[发明专利]一种脂肪酸光脱羧酶突变体及其在L-草铵膦合成中的应用

说明书

本发明公开了一种脂肪酸光脱羧酶突变体及其在L‑草铵膦合成中的应用，该脂肪酸光脱羧酶突变体为将SEQ ID No.2所示氨基酸第402位甘氨酸突变为苯丙氨酸；或者，第402位突变的同时第370位苏氨酸突变为精氨酸；或者，第402位突变、第370位突变的同时第513位丝氨酸突变为甘氨酸等。本发明利用定点饱和突变技术脂肪酸光脱羧酶基因进行突变，发现第370位、第371位、第402位、第513位、第514位是影响酶活和立体选择性的关键位点，获得酶活和ee值远高于母本脂肪酸光脱羧酶的突变体，最高的转化率为50％，产物ee值为96％。

技术领域

本发明涉及L-草铵膦生产技术领域，主要涉及一种脂肪酸光脱羧酶突变体及其在L-草铵膦合成中的应用。

背景技术

草铵膦，也称草丁膦，英文名为：Phosphinothricin(简称PPT)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸。草铵膦是一种内吸传导型除草剂，具有广谱杀草活性。除草剂用途广泛，国内外市场巨大，草铵膦为三大除草剂之一，近几年由于其作用机理和转基因技术，其市场份额有望进一步突破。

现在市场中的草铵膦主要为外消旋体。草铵膦有两种光学异构体：L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-草铵膦具有除草活性，是外消旋草铵膦的两倍，而且对人和动物的毒性较小，对环境影响小。但是，现在大规模生产的商品化草铵膦都是外消旋混合物的形式。外消旋草铵膦的使用，浪费巨大，而且对环境影响较为严重。为了减轻环保压力，减低生产成本，探索一条具有工业化应用前景的拆分外消旋草铵膦的生产路线具有重要的市场前景和社会意义。

目前，L-PPT的工业合成涉及通过化学合成或生物酶法进行不对称合成和外消旋拆分。然而，不对称合成方法通常需要昂贵的手性试剂，辅因子NADP⁺，酮酸底物或苛刻的反应过程，这些过程不符合“绿色化学”的标准。与不对称合成相比，外消旋拆分，尤其是酶促拆分是工业领域生产光学纯L-PPT的主要方法。

生物酶法拆分一般是通过化学合成外消旋D,L-草铵膦或其衍生物，再利用特定的酶选择性催化某一构型的反应，获得其中一个光学异构体，未反应的另一个异构体衍生物经过分离、消旋后，再进行酶催化反应，其理论产率可达100％；但酶法拆分也面临着复杂的工艺或生产纯化等关键问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有脂肪酸光脱羧酶对D,L-PPT酶法拆分制备L-PPT活性不高和底物浓度低的问题，提供一种立体选择性脂肪酸光脱羧酶突变体以及利用该脂肪酸光脱羧酶突变体基因的重组菌及其粗酶液作为生物催化剂制备L-草铵膦的方法；该突变体具有高酶活的特点，可高效催化D,L-PPT制备L-草铵膦。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种脂肪酸光脱羧酶突变体，所述脂肪酸光脱羧酶突变体为下列之一：

(1)将SEQ ID No.2所示氨基酸第402位甘氨酸突变为苯丙氨酸；

(2)将SEQ ID No.2所示氨基酸第402位甘氨酸突变为苯丙氨酸，且第513位丝氨酸突变为甘氨酸；

(3)将SEQ ID No.2所示氨基酸第402位甘氨酸突变为苯丙氨酸，且第514位丝氨酸突变为甘氨酸；

(4)将SEQ ID No.2所示氨基酸第402位甘氨酸突变为苯丙氨酸，且第370位苏氨酸突变为精氨酸；

(5)将SEQ ID No.2所示氨基酸第402位甘氨酸突变为苯丙氨酸，且第371位甘氨酸突变为异亮氨酸；

(6)将SEQ ID No.2所示氨基酸第402位甘氨酸突变为苯丙氨酸，第370位苏氨酸突变为精氨酸，且第513位丝氨酸突变为甘氨酸。