[发明专利]一种用于肿瘤类器官培养条件选择的CTNNB1基因突变的快速鉴定方法

说明书

一种用于肿瘤类器官培养条件选择的CTNNB1基因突变的快速鉴定方法，属于基因检测技术领域，其特征在于：所述的检测肿瘤组织的单个和多个CTNNB1基因突变；根据与癌发生相关的CTNNB1突变位点信息，自主设置筛选变异位点的方法步骤，并基于实时荧光定量PCR仪的ARMS‑PCR方法，设计专用引物和探针，经对具有不同CTNNB1基因突变的质粒DNA的单个检测或多个同时检测的实验验证而建立。该方法能在4小时内鉴定出肿瘤组织中是否含有CTNNB1基因突变，可准确高效地确定相应的肿瘤类器官培养条件，可操作性强，具有高准确性、高灵敏性的技术优势，检测结果稳定、效果明显，具有显著优势。

技术领域

本发明涉及一种用于肿瘤类器官培养条件选择的CTNNB1基因突变的快速鉴定方法，属于基因检测技术领域。

背景技术

中国作为一个癌症大国，癌症发病率居高不下，年新发病例约占全球总数的四分之一。国家癌症中心发布的最新一期全国癌症统计数据报告显示：2015年恶性肿瘤发病约392.9万人，发病率为285.83/10万，死亡约233.8万人，这意味着平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟有7.5人被确诊为癌症。近十多年来，我国癌症发病、死亡数均持续上升，恶性肿瘤发病率每年约有3.9％的增幅，死亡率每年约有2.5％的增幅。目前，随着靶向药物研究的持续深入，多种靶向特定致癌基因的药物不断进入临床，给广大患者带来了福音。然而，由于癌症的本质是受多基因突变影响的疾病，患者肿瘤会随着疾病的进展而不断演化，导致形成患者间的肿瘤异质性和同一肿瘤内的异质性。癌症异质性给靶向精准治疗增加了不确定性，同时也是导致癌症药物治疗耐药性的重要原因之一。为此，拓展针对癌症异质性的精准医疗具有重要的现实意义，而肿瘤类器官技术的兴起则为此提供了全新的更加有效的应用平台。

类器官是将具有成体干细胞潜能的细胞或组织在体外进行3D培养而成的三维微观结构。基于患者肿瘤组织的类器官培养被称为肿瘤类器官培养。肿瘤类器官具备自主生长及更新的能力，并且可以保留肿瘤组织特点和一定的遗传稳定性，因此与传统二维培养的肿瘤细胞系相比，肿瘤类器官具有更高的临床相关性和个体多样性，是目前最接近临床状况的体外肿瘤疾病模型。在技术应用上，肿瘤类器官疾病模型不仅在癌症的精准医疗上可用于指导患者用药的选择，同时在抗癌药物研发中，基于保有患者癌症异质性的标本库的建立，肿瘤类器官模型可更有效的评估临床前或临床试验中的先导化合物针对特定类型癌症的药效。肿瘤类器官已成为肿瘤基础研究中既模拟肿瘤生长的“环境”又具有患者特异性(优于实验动物模型)的最佳疾病模型，为临床研究和治疗中“有测序无靶点，有靶点无药物，有药物无疗效”的困境带来了曙光。

正因为肿瘤类器官能够保留原始肿瘤的性质，从而通过对肿瘤类器官的药物测试，可为肿瘤来源的病人选取考虑其癌症异质性的治疗方案，由此促进了癌症精准治疗的进一步研究和发展。然而，肿瘤类器官的培养技术面临着一些未知和挑战。挑战之一，肿瘤组织中往往混杂着正常组织，如选择的培养基不正确，随着传代培养，源自正常组织的类器官会逐渐替代肿瘤类器官，导致所培养的肿瘤类器官群体逐渐丧失肿瘤特性，使得针对肿瘤类器官的药敏测试得出非患者实际肿瘤状况的实验数据，对临床用药产生误导，以致延误患者选择精准有效药物的时间。

目前，多种方法已经用于应对上述挑战。以肝癌肿瘤类器官为例，基于肿瘤类器官在物理特性、细胞特性、肿瘤特有基因突变方面同正常类器官的区别，研究者采用过四种对肿瘤类器官进行特异性筛选的培养方法，但这些方法均存在着操作繁琐或对实验室要求很高等明显限制因素。第一种方法是在培养过程中人工操作处理，即在显微镜下使用工具剔除无“癌症类器官特征”、表型“正常”的类器官，该方法可行性低、错误率高；第二种方法是利用流式细胞仪将肿瘤组织细胞中的癌症干细胞分选提取，利用筛选出的高纯度的特定肿瘤细胞进行类器官培养，该方法不仅对硬件要求高，同时也存在所选特定癌细胞无法反映患者主要肿瘤性质的风险；第三种方法是根据已知的患者测序结果，调整培养基成分，筛选显示特定的癌症相关突变表型的类器官，该方法的问题是患者测序结果的获得往往滞后于肿瘤类器官的起始培养时间；第四种方法是通过对培养获取的肿瘤类器官进行测序来确定是否有与患者癌症相关的突变，该方法存在成本高和效率低的问题。