[发明专利]筛选能够表达期望产物细胞株的方法

说明书

本发明涉及一种筛选能够表达期望产物细胞株的方法，包括：将细胞池稀释后接种于细胞芯片中；所述细胞池中含有能够表达期望产物的细胞；对所述细胞芯片进行扫描，确认并记录拥有单克隆细胞的孔；对所述细胞芯片上的期望产物进行定量检测；分离所述期望产物的表达量高的单克隆。该方法可缩短细胞株构建时间、节约成本、减少工作量。

相关申请

本申请要求2019年10月30日申请的，申请号为201911044066X，名称为“筛选能够表达期望产物细胞株的方法”的中国专利申请的优先权，在此将其全文引入作为参考。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种筛选能够表达期望产物细胞株的方法。

背景技术

从细胞群中分离能够表达特定分泌物的细胞株的方法是生物领域的常见需求，但现有技术中分离方法常常存在低效率的问题。这样的特定分泌物典型的为蛋白，常常是外源蛋白表达，或者内源异质性的蛋白质，例如抗体。以哺乳动物表达系统为例，中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell，CHO细胞)表达系统是重组蛋白、抗体等药物生产的最主要宿主细胞。由于哺乳动物细胞生长慢、培养基成分复杂、生长条件苛刻，筛选表达目标蛋白的稳定和高表达细胞株耗时耗力、细胞培养成本高、技术复杂等因素，致使利用哺乳动物细胞生产蛋白质类药物的成本较高、周期长。快速筛选稳定、高产量的工程细胞株，是目前蛋白类药物研究和生产的主要瓶颈之一。

目前筛选细胞株的方法是利用单个筛选标记来筛选含有目标基因的稳定细胞株，单个筛选标记通常为抗性标记，如二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase，DHFR)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)、各种抗生素抗性基因等。具体来说，将筛选标记基因和目的基因构建到同一载体中，然后转染到宿主细胞中，从而实现两者的共同表达。但往往标记基因和目标基因表达水平相近，有可能筛选到的是只表达标记基因、而不表达目标基因的细胞。因而需要在成千上万个细胞中筛选到稳定的、高表达单克隆细胞。

传统细胞筛选方法步骤较为繁琐，首先需要将目的蛋白表达载体转染至宿主细胞，随后通过筛选药物加压，稳定细胞池形成；采用有限稀释法将稳定细胞池细胞接种到96孔或更多孔细胞培养板，并形成单克隆细胞群，随后进行上清蛋白表达量测定；高表达孔板中的细胞扩大培养至更大的孔板(如24孔板)；24孔板细胞扩至6孔细胞板；将6孔细胞板中细胞扩增至摇瓶中进行悬浮培养；进一步在摇瓶中评估不同细胞克隆的表达量；对摇瓶中表达量高的几个细胞株进一步进行亚克隆，将细胞再次用有限稀释法接种至96孔细胞培养板中；对亚克隆细胞进行新一轮表达量评估，过程同上；最终对筛选的细胞株进行连续传代，评估细胞株表达蛋白水平的稳定性，并根据细胞株表达目的蛋白的水平及细胞表现的稳定性确立候选细胞株。

以上筛选方法往往耗时6个月以上，需要大量人力物力支持。其中有限稀释法获得单细胞克隆，需要经过至少两轮的亚克隆，每一轮亚克隆需要将近3个月的时间；每个克隆需要从96孔或更多孔板扩增至24孔板，并进行表达量评估，有时克隆多达数千个，工作量巨大；将细胞从24孔中进一步扩大至摇瓶培养，摇瓶数量往往达到数百个，需要大量人力成本，且消耗大量的试剂耗材。无法满足大规模产业化生产的需求。

发明内容

本发明涉及一种筛选能够表达期望产物细胞株的方法，包括：

a)将细胞池稀释后接种于细胞芯片中；

所述细胞池中含有能够表达期望产物的细胞；

b)对所述细胞芯片进行扫描，确认并记录拥有单克隆细胞的孔；

当所述期望产物为分泌性物质或附着于细胞膜表面的物质时，所述方法还包括c1和d：当所述期望产物为胞浆非分泌性物质时，所述方法还包括c2和d：