[发明专利]一种高粱原生质体的制备方法及瞬时表达转化的方法

说明书

本发明公开了一种以高粱BTx623幼苗为材料，以酶解法获得大量高粱原生质体及使用聚乙二醇介导法对高粱原生质体进行转化的方法。具体步骤包括：一、挑选饱满的高粱种子，消毒后种于培养基中；二、选取生长良好的高粱幼苗，去除叶和根，保留中间叶鞘部分，用刀片切成细条，在甘露醇溶液中预处理后加入酶解液进行酶解；三、酶解结束后，利用离心法富集原生质体，并重悬；四、利用聚乙二醇介导法转化所得原生质体。本发明建立了稳定高效的高粱原生质体分离及转化体系，该方法快速高效、转化率高，能够用于目的基因表达、蛋白质亚细胞定位和蛋白质互作等，为高粱的遗传改良和基因功能组研究提供了一个有力的工具。

技术领域

本发明涉及一种高梁原生质体的制备方法及制备的原生质体的转化方法。

背景技术

高粱是一年生禾本科C₄植物，可作为食用、饲用、酿造和生物能源等方面，具有广泛的适应性和良好的抗逆性，在全世界和我国各地均广泛种植，具有较高的经济价值和研究价值。然而高粱存在转化难、再生难等问题，利用常规遗传转化技术对其进行转化，如农杆菌侵染法，存在效率低、再生难和周期长等难点，限制了高粱的遗传改良和功能基因组研究的发展。

植物原生质体是植物细胞去除细胞壁后裸露的细胞，具有容易摄取外源核酸片段的特性。自1960年Cocking等首次利用纤维素酶粗制剂，从番茄根尖中分离出大量的原生质体以来，多种植物如拟南芥、水稻、玉米、烟草等都建立了原生质体分离系统。植物瞬时表达是一种将目标基因转入靶细胞，并在短时间内使外源基因高效表达的技术。；利用原生质体易于摄取外源基因的特性，为植物瞬时表达技术的应用提供了良好的实验系统。在植物原生质体中进行瞬时表达所需时间短，不需要将外源基因整合到靶细胞基因组中，被广泛应用于蛋白的亚细胞定位、基因瞬时表达、蛋白质互作、启动子活性等多种植物基因功能研究中。目前高粱缺少稳定高效的原生质体瞬时表达体系，因此建立高粱原生质体制备及转化体系对高粱的遗传转化、基因功能研究是具有重要意义的。本发明利用高粱幼苗成功建立了稳定、高效、快速的高粱原生质体瞬时表达体系，克服了高粱难以转化的问题，为在高粱中进行遗传育种和基因功能组研究提供了一个有力的工具。

发明内容

本发明的目的是提供一种高粱原生质体的制备方法。

为此，本发明提供的技术方案为：

一种高粱原生质体的制备方法，包括如下步骤：

（1）挑选饱满的高粱种子消毒后接种于MS培养基中，移至组培室中培养；

（2）选取步骤（1）中培养良好的幼苗，取其中间叶鞘部分，用刀片迅速切成条状，放入装有甘露醇溶液的容器中进行预处理；

（3）移除甘露醇，加入酶解液，避光，置于摇床上低速震荡，真空处理20-90 min后继续酶解高粱材料；

（4）酶解结束后，对高粱原生质体进行分离纯化，得到高活力的高粱原生质体。

步骤（2）中所述甘露醇溶液预处理为：在切成细条的高粱材料中加入0.5-0.7 M的甘露醇溶液，避光，质壁分离20-30 min。

步骤（3）中所述酶解液的配置方法为：称取甘露醇、纤维素酶和离析酶，加入吗啉乙磺酸溶液及双蒸水，在50-55℃水浴锅中孵育后冷却到室温，经过滤再加入CaCl₂溶液、β-巯基乙醇和小牛血清蛋白即可得到酶解液。

所述酶解液中各组分的最终浓度为：甘露醇0.5-0.7 M、纤维素酶0.5-2wt%、离析酶0.15-0.75 wt %、吗啉乙磺酸8-12 mM、 CaCl₂ 0.5-3 mM、β-巯基乙醇3-8 mM、小牛血清蛋白0.05-0.2 wt %。

所述原生质体分离包括如下步骤：将酶解液用200目的尼龙网初步过滤，将收集的滤液在2-4℃下、离心，移除上清，用W5溶液重悬原生质体即可。