[发明专利]用于DuHCV和DuMV双重TB Green实时荧光定量PCR检测的引物组

说明书

本发明涉及一种用于鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒双重TB Green实时荧光定量PCR检测的引物组，所述引物组的序列如SEQ.ID.No.1‑SEQ.ID.No.4所示，本发明建立能够同时对鸭群中流行的DuHCV和DuMV进行检测和精确定量的TB Green实时荧光定量PCR方法，该方法能简化操作程序、节约成本、检测快速、高效、灵敏度高，DuHCV的最低检测限为82.5拷贝/μL；DuMV的最低检测限为45.7拷贝/μL、特异性强。

技术领域

本发明属于动物传染病学领域，具体涉及一种用于鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒双重TB Green实时荧光定量PCR检测的引物组。

背景技术

实时荧光定量PCR方法(real-time qPCR)就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点，real-time qPCR由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速，已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。目前根据实时荧光定量PCR所使用荧光化学物质的不同，实时荧光定量PCR技术主要包括荧光染料和荧光探针两类。荧光染料法是在PCR反应体系中，加入TB Green荧光染料，TB Green荧光染料非特异性地结合DNA双链后，发射荧光信号，而未结合DNA双链的TB Green染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。TB Green仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。

根据国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy ofViruses)的最新分类，黄病毒科(Flaviviridae Family)下设4个病毒属：黄病毒属(Flavivirus)，有53个病毒种，有些是人畜共患病原体，如流行性乙型脑炎病毒、登革热病毒；丙型肝病毒属(hepacivirus)，有14个病毒种；Pegivirus病毒属，有11个种；瘟病毒属(Pestivirus)，有11个种，常见的如猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒。丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是属于黄病毒科、丙型肝炎病毒属的单股正链RNA病毒，其病毒粒子呈球形，直径约40-60nm，核衣壳呈二十四面体对称，核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有刺突。鸭丙型肝炎病毒(duck hepacivirus，DuHCV)是从患有产蛋异常现象的鸭群中新发现的一种丙型肝炎病毒，其基因组具有一般丙型肝炎的特征，为单股正链RNA，基因组长为11422bp，编码一个长度为10824bp的开放阅读框(open reading frame，ORF)，编码的多聚蛋白长为3607个氨基酸。

微核糖核酸科(Picornaviridae Family)病毒是重要的人畜共患病原体,它会导致人和动物出现亚临床感染或从轻度发热到心脏、肝脏和中枢神经系统的严重疾病。微核糖核酸科病毒是一类二十面体对称、呈球形，直径约20-30nm、无囊膜的单股正链RNA病毒。微核糖核酸科病毒包含63个病毒属，常见的有口蹄疫病毒属(Aphthovirus)、肠病毒属(Enterovirus)、心病毒属(Cardiovirus)、肝病毒属(Hepatovirus)等。微核糖核酸科病毒基因长度一般为6.6kb-9.8kb，基因组一般仅含有一个大的开放阅读框(open readingframe，ORF)，3’端为Poly A尾，5’端有VPg蛋白与之共价结合，基因组RNA有感染性。近年来，随着病毒宏基因组学研究的不断深入，归属于微核糖核酸科Megrivirus属的病原先后从火鸡、鸡、鸽子和鸭中发现。基因组学分析发现，鸭新型微核糖核酸病毒(duck megrivirus,DuMV)的基因组结构特征和火鸡源Megrivirus、鸡源Megrivirus相似，且其聚蛋白含有典型微核糖核酸科病毒的特征性基序。遗传进化分析表明，鸭新型微核糖核酸病毒(DuMV)与Megrivirus属的火鸡、鸡、鸽子源新型微核糖核酸病毒处于同一遗传进化分支。