[发明专利]检测对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌的引物组及含有该引物组的试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测对虾急性肝胰腺坏死病‑副溶血弧菌的引物组及含有该引物组的试剂盒，属于水产病原生物检测试剂技术领域。本发明检测对虾急性肝胰腺坏死病‑副溶血弧菌的引物组，根据SEQ ID No:1所示核酸序列设计。用本发明引物组检测对虾急性肝胰腺坏死病‑副溶血弧菌，不仅克服了现有技术中对大型昂贵仪器依赖、检测操作复杂的问题；而且，本发明引物组的检测灵敏度高、特异性好，适用于水产养殖场等简陋条件的快速测定。

技术领域

本发明属于水产病原生物检测试剂技术领域，具体涉及一种检测对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌的引物组及含有该引物组的试剂盒。

背景技术

急性肝胰腺坏死病( acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)，又被称为早期死亡综合征(early mortality syndrome, EMS)，是近年来严重危害对虾养殖的一种新发疫病。该病2010年前后首先在越南和中国的对虾养殖中出现，随后传播到东南亚以及中美洲等地，该病在放苗后7~31 d出现肝胰腺萎缩、发黄，死亡率达90%，使全球对虾养殖业每年损失近10亿美元；严重影响了对虾产业的发展。对于AHPND的病原，至今还未有明确的定论，目前比较公认的病原是一种独特的副溶血弧菌分离株(Vibrioparahaemolyticus causing AHPND，VpAHPND)，该副溶血弧菌携带含有二元Pir样毒素基因pirA^vp和pirB^vp的69 kbp质粒(pAP1)；研究发现，因该副溶血弧菌含有编码PirA和PirB毒素的质粒而对虾类具有致死性。

水产病原的快速诊断，对水产养殖的良种选育，疾病预防、进出口检疫、水产品食品安全等方面具有重大意义。当前，水产病原防治中常见的病原检测方法包括组织病理切片观察、病毒分离培养、抗原血清反应、酶联免疫吸附剂测定（ELISA）、核酸杂交技术和一般聚合酶链反应（PCR）技术等。目前的检测方法均存在依赖精密仪器、检测成本高、灵敏性和特异性差，操作程序繁琐，难以推广等缺点；而且常规的病原检测技术大都不适合养殖基层的现场快速检测。

LAMP技术是一种新的DNA扩增方法，该技术依赖于自动循环的链置换反应，通过识别靶序列上6个特异区域的引物和具有链置换的DNA聚合酶，在等温条件下，不到1 h就能扩增出10⁹靶序列拷贝，具有特异、灵敏、快速、简便等特点，与普通PCR、荧光定量PCR技术相比，LAMP的优点突出：（1）不需要昂贵的精密仪器，恒温状态即可；（2）扩增效率高，能够获得大量扩增产物；（3）具有高特异性；（4）通过添加Loop引物，可以加快反应，缩短一半的时间；（5）因扩增产生大量的副产物焦磷酸镁白色沉淀，肉眼即可观察结果。因而，可以检测水产经济动物体内的病原菌、病毒、寄生虫和真菌等病原生物，适合于养殖基层的现场快速检测。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测对虾急性肝胰腺坏死病病原-副溶血弧菌的引物组及含有该引物组的试剂盒，用本发明引物组检测对虾急性肝胰腺坏死病的病原副溶血弧菌，不仅克服了现有技术中对大型昂贵仪器依赖、检测操作复杂的问题；而且，本发明引物组的检测灵敏度高、特异性好，适用于水产养殖场等简陋条件的快速测定。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

检测对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌的引物组，所述引物组序列为：

F3：5’- GTCGTGGTTTCTGTACAATC -3’；

B3：5’- GCCAAAAGATATTCCATAACGT -3’；

FIP：5’- AGGGTTAAATTCCGTCAAAGATGACTAAGAAGGTGCTCACATGAC -3’；