[发明专利]一种增强稻瘟病抗性的miRNA的克隆与应用

说明书

本发明公开了一种增强稻瘟病抗性的miRNA的克隆与应用，属于植物基因工程技术领域。本发明miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明发明人鉴定并证实了miRNA‑T34可以通过抑制LOC_Os02g39410和LOC_Os01g46500的表达以调节水稻基础免疫反应，从而正向调控稻瘟病抗性。结合利用过表达miRNA技术上调miRNA‑T34，可以显著提高水稻对稻瘟病的抗性，具有较好的应用前景。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种增强稻瘟病抗性的miRNA的克隆与应用。

背景技术

稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的一种破坏性病害，在水稻区常造成巨大的经济损失(Yi et al，2004)。实践证明，鉴定和利用广谱抗性基因进行水稻抗病育种是防治稻瘟病最为经济有效的策略(Deng et al，2006)。截至目前，研究人员先后用从不同抗病品种中鉴定出80多个稻瘟病抗性基因，已鉴定和克隆的基因分别以单基因或基因簇的形式分布在除3号染色体外的其它11条染色体上，且多个抗病基因成簇分布，主要存在于第6、11、12染色体。尽管全国各地选育出一批抗病或耐病的高产品种，但是新选育品种的抗源在总体上略呈单一化；长期单一化使用个别抗病基因会使得对应的无毒基因发生变异，使得部分用于品种选育的抗性基因在经过多代传递后，其抗性不能持久，并在适宜于稻瘟病菌的环境条件下，可造成大面积爆发。因此，需要多途径拓宽抗源，结合多基因聚合育种及生物技术等手段培育持久抗病新品种。

miRNAs是一类长度约21-24nt的非编码小RNA，属于一类有效的转录后基因调控因子。主要通过互补碱基配对蛋白质编码基因，导致mRNA降解或翻译抑制，从而调节许多细胞功能和过程，包括细胞增殖、分化、凋亡以及应激反应和病原防御(Bartel et al.，2004)等。在不同的植物中已经发现了大量的miRNA，这些miRNAs不仅调节生长发育，还调节重要的生理过程(Mallory et al.，2006；Jones-Rhoades et al.，2006；Li et al；Bartel etal.，2004；Zhang et al.，2013)。一些miRNAs甚至还通过调节NBS-LRR类因参与应对病原物的侵染(Zhai et al.，2011)。例如，NTA-miR6019和NTA-miR6020引导TIR-NBS-LRR免疫受体N的转录本的序列特异性切割，该转录本赋予烟草植株对烟草花叶病毒(TMV)的抗性。在烟草中，超级miRNA家族miR482针对NBS-LRR抗病基因，其N端具有卷曲的结构域。此外，一些miRNAs还参与NBS-LRR基因的切割，并产生阶段排列的串联siRNAs。

miRNA的调控与抗病反应途径具有重要的关系，如王兴军等发明的“利用人工miRNA提高水稻抗黑条矮缩病的方法及其专用双链RNA”(中国专利CN102676510A)，公开了一种利用人工miRNA提高水稻抗黑条矮缩病毒的方法及其专用双链RNA，我们也在前期公开了“一种稻瘟病抗性相关的miRNA及其应用”(中国专利ZL201711155567.6)，该miRNA主要靶向负调控抗病基因Pik-H4来调控抗病性，这些研究表明对miRNA的表达的调节可用于增强植物抗病性。进一步分析并克隆稻瘟病抗病反应相关的miRNA，可为更好控制和降低稻瘟病菌对水稻的危害，增强植物的抗病性提供新思路，具有重要的应用价值。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种增强稻瘟病抗性的miRNA。它通过靶向负调控LOC_Os02g39410与LOC_Os01g46500提高了水稻稻瘟病抗性。

本发明的另一目的在于提供上述增强稻瘟病抗性的miRNA的应用。过表达该miRNA能显著增强稻瘟病抗性，可通过在水稻中过表达该miRNA以提高水稻的稻瘟病抗性。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种增强稻瘟病抗性的miRNA，其核苷酸序列如下所示(亦如SEQ ID NO:1所示)：