[发明专利]一种合成D-阿洛酮糖的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

一种合成D‑阿洛酮糖的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明提供一种能够利用D‑果糖合成D‑阿洛酮糖的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法，具体是以枯草芽孢杆菌WB600为宿主菌，敲除了其基因组上的果糖激酶基因及PTS系统果糖特异性转运蛋白元件IIABC、IID的基因，得到枯草芽孢杆菌突变体，并进一步在宿主菌中游离表达来源于球形节杆菌(Arthrobacter globiformis M30)的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶编码基因，获得重组枯草芽孢杆菌。本发明的基因工程菌实现了底物D‑果糖的充分利用，大大提高了生物合成D‑阿洛酮糖的产量，有利于D‑阿洛酮糖的工业化生产，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种合成D-阿洛酮糖的基因工程菌及其构建方法与应用，属于生物技术和基因工程技术领域。

背景技术

D-阿洛酮糖是稀有糖家族的重要成员，是一种新型的低能量的甜味剂。因具有较高的甜度和较低的能量，D-阿洛酮糖被认为是一种理想的甜味剂和蔗糖的有效替代品。可帮助制造商减少配方中的蔗糖，用于开发低热量食品饮料。同时，D-阿洛酮糖可以发生美拉德反应，有助于提升食品品质，可以完美替代糖的功能。此外，D-阿洛酮糖还具有独特的生理功能，在临床医学领域具有潜在较大的应用价值。例如治疗肥胖症、糖尿病、高血压、高血脂和动脉粥样硬化等疾病，D-阿洛酮糖还可以通过添加辅料进行喷雾干燥，进而有助于肺部药物给送。2011年美国FDA批准D-阿洛酮糖为GRAS物质，2019年，FDA又宣布将低热量甜味剂D-阿洛酮糖排除在“添加糖”、“总糖”标签之外，因此不需要在这两项类目中计算其添加量，无疑将帮助其在未来进一步扩张市场。

D-阿洛酮糖的制备方法主要有化学合成法和生物转化法，化学合成法主要是通过一些催化加氢、加成反应、Ferrier重排等反应来合成，但是这些化学合成方法存在反应步骤多、反应条件苛刻、产率较低、副产物多和分离纯化困难等缺点。利用生物合成法生产D-阿洛酮糖，是利用微生物所产特异性的酶，专一性的催化底物合成D-阿洛酮糖。D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-allulose-3-epimerase，DAE)可以催化多种酮糖C3位的差向异构，是生产稀有糖的良好催化剂，以D-果糖为底物生产附加产值高的D-阿洛酮糖。目前为止，已经筛选并鉴定了至少18种酮糖3-差向异构酶，它们对D-塔格糖、D-阿洛酮糖、D-果糖、L-核酮糖具有较高的底物特异性。

pKSV7温敏质粒无痕敲除技术是基于温敏型质粒而不是线性DNA的方法用于快速敲除枯草芽孢杆菌染色体上的目的基因。pKSV7该质粒的基因组中含有：1)仅一种正筛选标记的抗性基因，该抗性基因的启动子为双功能启动子；2)能在大肠杆菌中复制的复制子；3)能在芽胞杆菌中复制的温敏型复制子。该技术的原理是以出发菌枯草芽孢杆菌WB600基因组为模板扩增得到待敲除基因的上下游同源臂，将上下游同源臂连接后，通过酶切位点的方式连接到pKSV7温敏质粒上构建同源重组载体；然后将重组载体导入WB600中，通过筛选得到带有抗性标记的重组菌，改变培养温度，筛选无抗性标记的重组菌。得到目的基因缺失的重组菌，并在DNA水平进行鉴定。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为枯草杆菌的一个属，是非致病菌且不含内毒素以及致热致敏蛋白，被FDA和中国农业农村部等部门批准为食品级安全菌株。枯草芽孢杆菌发酵技术历史悠久且研究充分，其表达系统没有明显密码子偏好性，具有很强的蛋白分泌功能，细胞壁组成简单，严格好氧性生长，培养条件简单且生长迅速，遗传背景研究比较清楚，并且具有良好的发酵基础。

专利申请(CN 108251468 A)公开了一种生物法生产D-阿洛酮糖的工艺，包括由D-果糖制备生产D-阿洛酮糖的方法、由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺和由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺。该生物法生产D-阿洛酮糖的工艺旨在重组细胞中表达3-差向异构酶；通过使用所表达的3-差向异构酶由D-果糖制备D-阿洛酮糖。本发明的生物法生产D-阿洛酮糖的工艺选用的3-差向异构酶具有活性高、耐高温、稳定性好的优点，根据该发明的生产D-阿洛酮糖的工艺可由D-果糖或廉价的原料如蔗糖或D-葡萄糖大规模且连续地制备D-阿洛酮糖。