[发明专利]一种应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法

权利要求书

1.一种应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，将放线菌选择培养基加入96孔细胞培养板各孔室，土壤样本经稀释后添加至96孔板各孔室进行放线菌培养，达到隔离培养的效果。

2.根据权利要求1所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、平板菌落计数：称取土壤样本，加入无菌水进行系列稀释，得到稀释倍数成梯度的稀释液；分别吸取稀释液涂布ISP2平板，28-30℃培养7-14天，进行平板菌落计数，得出土壤样本稀释倍数，稀释液添加量和菌落数之间的关系；

S2、96孔细胞培养板铺制：将呈液体状态的ISP2培养基倒入储液槽，使用微量移液器向96孔板各孔室加入ISP2培养基，待凝固后使用；

S3、土壤样本稀释和点板：根据平板菌落计数结果换算出土壤样本稀释倍数达到0.4-0.8个菌落/孔的理论值；称取土壤样本，按换算出的稀释倍数进行土壤样本的稀释，得待筛选土壤稀释液；向步骤S2中96孔板的各孔室加入所述待筛选土壤稀释液，静置；

S4、放线菌培养和纯化：将步骤S3的96孔板置于恒温培养箱中28-30℃倒置培养7-12天后，从96孔板各孔室挑取单菌落，在ISP2平板上连续划线，划线后置于恒温培养箱中28-30℃倒置培养2-10天；

S5、放线菌筛选和鉴定：基于菌落特征识别霉菌，霉菌之外的菌株基于16S rDNA序列分析法进行鉴定。

3.根据权利要求2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，步骤S1和S4中，所述ISP2平板是将ISP2培养基倒入培养皿，待培养基凝固制备而得。

4.根据权利要求1或2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，所述ISP2培养基是将酵母浸粉4g，麦芽浸粉10g，葡萄糖4g，琼脂粉15g，用去离子水定容至1000ml，调节pH至7.2，115℃高压蒸汽灭菌30min，冷至55-60℃时，加入K₂Cr₂O₇和萘啶酮酸，混合均匀而得；所述K₂Cr₂O₇的终浓度为50μg/ml，所述萘啶酮酸的终浓度为20μg/ml。

5.根据权利要求2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，步骤S1中，稀释倍数成梯度的稀释液为10倍、100倍、1000倍三个梯度的稀释液。

6.根据权利要求2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，步骤S2中，使用8道或12道微量移液器向96孔板各孔室加入ISP2培养基100或200μl。

7.根据权利要求2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，步骤S3中，使用8道或12道微量移液器向96孔板各孔室加入所述待筛选土壤稀释液5-10μl，静置5-10min，使菌液吸附进培养基。

8.根据权利要求2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，步骤S5中，霉菌菌落的培养特征包括霉菌菌落较大，质地疏松，外观干燥，不透明，呈现或松或紧的形状。

9.根据权利要求2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，步骤S5中，16S rDNA序列分析法鉴定步骤包括菌株小量培养、基因组DNA小量提取、PCR扩增16S rDNA片段和16S rDNA序列比对分析。

10.根据权利要求2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，PCR扩增16S rDNA片段采用细菌16S rRNA基因测序通用引物27F和1492R作为PCR扩增引物。