[发明专利]一种用于表征肺腺癌气虚痰湿证的分子标记物组合及筛选及模型建立的方法

说明书

本发明公开了一种用于表征肺腺癌气虚痰湿证的分子标记物组合及筛选及模型建立的方法，分子标记物组合为B3GNT7，METTL7B，TMEM41A，MKRN3，ANK2，EIF5，DDR2，GPER1，PPARG，MRAS；包括获取样本的单核白细胞PBMCs：清晨收集空腹静脉血2‑4ml，PBS与人外周血等体积混匀，加入等体积淋巴细胞分离液液面上，400g，室温，离心30min，取中间白膜层，加入10倍体积PBS洗去淋巴细胞分离液，重复两次后，计数并加入RPMI 1640完全培养基重悬备用等步骤，本发明为肺腺癌气虚痰湿证的辨证论治提供临床辅助工具，提升中医药治疗的科学内涵，促进中医、中西医结合防治肺癌水平的提升。

技术领域

本发明属于临床医学、分子医学、检验医学、中医学或中西医结合医学领域，具体的说，是一种用于表征肺腺癌气虚痰湿证的分子标记物组合及筛选及模型建立的方法。

背景技术

气虚痰湿证是非小细胞肺癌的中医典型证候，也是具有中医学特有的学术概念。其判断方式为中医临床医师经四诊合参后得出主观判断结论，这一模式延续至今，其主要内容即参考《中药新药临床研究指导原则(2002)》、《恶性肿瘤中医诊疗指南》中的相关内容，但缺乏客观量化的标准，且结果的准确性因中医医生临床水平的高低而表现出显著差异性，开展临床研究及推广均受到限制。中医证型的客观量化是目前制约中医学进一步发展的科学难题，也是中医学难以纳入现代科学评价体系并与其他学科进行直接交流的重要原因。但是，中医、中西医结合对于肺癌的临床疗效肯定，对于气虚痰湿证人群，诸多临床研究表明其可以作为判断预后的独立因素，且也有极大可能是靶向治疗获益的优势人群。因此，研究非小细胞肺癌气虚痰湿证的生物学内涵可为解决上述科学难题提供研究依据。针对非小细胞肺癌的科学研究表明，在蛋白、基因等各个分子层面均可找到能反映恶性肿瘤生物学特征的分子标记物，如驱动基因EGFR、ALK等及其相关的蛋白及miRNA等。基础研究表明，气虚痰湿证的生物学内涵比较复杂，可能涉及炎症、免疫、细胞凋亡等多个内容。因此，将上述两者相结合并运用科学方法从中筛选出具有客观表征中医证型作用的分子标记物是科学可行的。目前，已有运用多组学技术探索中医证型生物学内涵的研究并发现了诸多分子标记物，但可表征非小细胞肺癌气虚痰湿证的分子标记物的研究未见报道；人体的代谢产物、蛋白表达等因易受到疾病阶段、生活环境等较多因素的影响，其在表征中医证型上的特异性和准确性不足；而作为其上游的基因，其功能结构及表达具有较好的稳定性，可通过转录组第二代测序技术(RNA-Sequenc,RNA-Seq)进行检验，进而通过生信分析后有助于揭示特定疾病阶段的内在分子机制及发生发展的过程，也是目前探究中医证型生物学基础的重要技术手段。在此基础上，运用统计学方法及数学建模等方式，有助于将筛选得到分子标记物转化为客观量化非小细胞肺癌气虚痰湿证的核心参数，有助于开展临床研究及推广。

发明内容

本发明针对目前肺腺癌气虚痰湿证缺乏客观分子标记物的现状，作出了改进，提供了一种基因组合用于表征肺腺癌气虚痰湿证的用途及筛选及模型建立的方法，通过前期研究已证实，肺腺癌气虚痰湿证是EGFR-TKIs的优势人群，其OS达到了26.5个月。进一步运用RNA-Seq技术表征了肺腺癌气虚痰湿证患者、非气虚痰湿证患者以及健康人群的单核白细胞的转录组，运用ROC曲线判定方法筛选得到了B3GNT7，METTL7B，TMEM41A，MKRN3，ANK2，EIF5，DDR2，GPER1，PPARG，MRAS等10个差异表达基因，经过PCR组外验证及分析后得到了五个特别显著基因TMEM41A，EIF5，DDR2，PPARG，MRAS，并以DDR2/PPARG的对数值作为自变量建立了逻辑斯蒂回归模型，实现了客观量化非小细胞肺癌气虚痰湿证这一目标，并为临床推广提供了方法及检验核心参数，这一分子标记物组合的碱基序列及其在本领域中的合理变形，均属于本发明技术方案要保护的内容。

这10个基因的具体的碱基序列为：

GTTGCCAGAGATTTCTGAAGACACA TCCACCAGGGCACAGTCAA

ATGGCTCCATGGATGTGGTG GGCCCAGCTTCCATATGGTTC