[发明专利]一种腺病毒全基因组捕获方法、引物组以及试剂盒

说明书

本发明涉及一种腺病毒全基因组捕获方法、引物组以及试剂盒，本发明需少量RNA便可方便快速的扩增出腺病毒全基因组，可直接对接二代测序建库试剂和三代测序平台，获得腺病毒全基因组序列。

技术领域

本发明属于病毒检测领域，具体涉及到一种腺病毒全基因组捕获方法、引物组以及试剂盒。

背景技术

人腺病毒（Human adenovirus，HAdV）肺炎是儿童社区获得性肺炎中较为严重的类型之一，多发生于6个月至5岁儿童，部分患儿临床表现重，肺炎并发症多，重症病例易遗留慢行气道和肺疾病，是目前造成婴幼儿肺炎死亡和致残的重要原因之一。

HAdV属于哺乳动物腺病毒属，为无包膜的双链DNA病毒，目前已发现至少90个基因型，分为A-G共7个亚属，不同型别HAdV的组织侵染性，致病力，流行地区等特征不同。与呼吸道感染相关的HAdV主要有B亚属（HAdV-3、7、11、14、16、21、50、55型），C亚属（HAdV-1、2、5、6、57型）和E亚属（HAdV-4型），腺病毒肺炎约占社区获得性肺炎的4%-10%，重症肺炎以3型及7型多见。在中国主要流行的是腺病毒3型，7型，11型，14型，55型。

腺病毒核酸检测的方法灵敏度和特异度较高，目前以荧光定量PCR方法为主，实践显示其检测特异性高，成本低，操作方便。但是，该类试剂盒是根据已知病毒序列设计特异性引物和探针，因此只能鉴别已知病毒类型，不能鉴定未知新型病毒；此外，由于病毒基因序列变异，会导致引物和探针扩增失败，检测敏感性降低，因此需要定期更换引物和探针，并重新进行实际评估，而且应用荧光定量PCR方法鉴定腺病毒假阴性情况经常发生。

此外，基于宏基因组测序（metagenomics Next Generation Sequencing，简称“mNGS”，又称“宏基因组学”）的检测方法，能够鉴别诊断包括腺病毒在内的其他呼吸道病原的感染，实现病毒序列的快速检测。基于宏基因组新一代测序技术(mNGS) 不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，能够快速、客观的检测临床样本中的多种病原微生物（包括病毒、细菌、真菌、寄生虫），尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断。随着mNGS 技术平台的完善和临床研究的增多，mNGS在临床上的运用将越来越广泛。2016年美国FDA认可用二代测序技术进行微生物鉴定及耐药毒力分析；2019年病原宏基因组学被写入成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南。

测序指的是对基因的序列进行判断的一种方法。每个物种的基因控制生物性状的表达，而测序是指对基因的序列进行判断。第二代测序（NGS）又称为高通量测序（High-throughput sequencing），是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。目前测序技术已发展到第三代，第三代测序技术是指单分子测序技术。DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。第三代测序技术也叫从头测序技术，即单分子实时DNA测序。近年，新一代测序技术（NGS）（也称之为二代测序）和纳米孔测序技术（Nanopore)(也称之为三代测序）越来越多的应用于未知病原体的诊断。目前全球爆发的SARS-CoV-2病毒能在较短时间内，获得病毒基因组全序列，也都是得益于测序技术。

通常，测序技术在疾病流行和爆发中有三个作用：1、鉴定未知病原体，只有获得病原全基因组才能确定新病原的身份；2、流行病发展阶段可用于直接对临床样品开展检测，实时动态监测病毒基因组的突变情况以及辅助假阴性样本确诊；3、常规检测阶段，可以用于耐药位点筛选，也可以用于日常的呼吸道感染鉴别，提升呼吸道疾病的检测准确度。