[发明专利]一种促进宿主细胞生长速率及其底物利用的方法及应用

说明书

本发明提供了一种促进丝状真菌生长速率及其底物利用的方法及其在微生物发酵中的应用，属于基因工程领域。利用敲除、突变等基因工程方法对丝状真菌调控因子LaeA进行改造，所得到的重组菌株，获得生长速率和底物利用速率显著提高的能力，进而提高发酵生产有机酸等生物基化学品的生产效率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及调控因子LaeA在提高嗜热毁丝霉生长速率及糖代谢中的功能及其应用。

背景技术

丝状真菌是一类重要的真核微生物，广泛存在于自然界中，在工业、农业和医药等领域发挥着重要作用。里氏木霉、黑曲霉、米曲霉以及嗜热毁丝霉被广泛用于生产工业酶制剂(如纤维素酶、葡萄糖淀粉酶和淀粉酶等)和有机酸(如柠檬酸等)。与细菌、酵母相比，丝状真菌具有较高的蛋白质分泌能力，能够利用简单、廉价的培养基进行生长，在工业发酵中受到了关注。但值得注意的是丝状真菌一般存在底物利用速率低，生长较慢等问题，使得丝状真菌发酵周期较长，目标产品产率及生产强度较低，成为解决发酵成本较高、生产设备利用率低等问题的关键。

嗜热毁丝霉是天然纤维素降解高温丝状真菌，是耐高温纤维素酶的优良生产者，天然具有分泌大量生物质降解酶类的能力。嗜热毁丝霉最适生长温度为45-48℃，与纤维素酶最佳酶活温度50℃非常接近，是发酵工业非常卓越的底盘细胞。目前，经过代谢工程改造后，嗜热毁丝霉已被用于发酵生产大宗化学品，如苹果酸、富马酸等。嗜热毁丝霉最适生长温度较高，可以节约发酵过程中的冷却水用量，降低生产成本，已被证实可以用来大规模工业发酵（Visser H, Joosten V, Punt PJ, Gusakov AV, Olson PT, Joosten R, BartelsJ, Visser J. Development of a mature fungal technology and productionplatform for industrial enzymes based on a Myceliophthora thermophilaisolate, previously known as Chrysosporium lucknowense C1. Ind Biotechnol.2011;7:214-23）。但是嗜热毁丝霉存在生长速率慢、发酵周期长、纤维素酶分泌相对较低等问题，限制了其工业发酵中的广泛应用。因此，有必要开发生长速率快，发酵时间短，生产有机酸如苹果酸等的产量高的嗜热毁丝霉。

全局调控因子LaeA为蛋白甲基转移酶，前期研究表明LaeA参与调控丝状真菌发育、次级代谢合成等生理过程。在本发明中通过实验证实LaeA蛋白与重要的工业丝状真菌嗜热毁丝霉的生长速率及其底物利用和发酵时间相关，突变其编码基因后能够显著目标产物的生产效率，极具推广意义。

发明内容

本发明提供了一种提高丝状真菌嗜热毁丝霉底物利用和生长速率的方法。经验证，本发明能够显著提高嗜热毁丝霉苹果酸工程菌株的生长速率，显著提高有机酸的生产效率。为达此目的，本发明采用以下技术方案。

第一方面，本发明提供一种重组丝状真菌，其特征在于，利用基因工程方法抑制丝状真菌细胞中的调控因子LaeA表达水平而获得或通过突变使其丧失/降低活性，其生长速率和/或碳源底物利用的能力得以提升，其中优选的所述碳源底物选自单糖、多糖、聚糖、植物生物质、或其组合，优选地所述多糖选自蔗糖，麦芽糖，纤维二糖，纤维寡糖，木二糖，木寡糖或其组合；所述聚糖选自所述的聚糖包括纤维素、半纤维素、蔗糖、淀粉或其组合；所述的单糖选自葡萄糖，木糖，阿拉伯糖或其组合。

在更具体的实施方式中，所述调控因子LaeA为具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽以及同源性达到或超过70%,优选80%，90%，95%，以及99%的氨基酸序列,优选其源自丝状真菌,更优选源自毁丝霉，最优选源自嗜热毁丝霉。

更优选地，所述调控因子LaeA为具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽，优选其编码核苷酸是如SEQ ID NO.2所示。