[发明专利]一种快速鉴定二倍体基因编辑作物T0

权利要求书

1.一种快速鉴定二倍体基因编辑作物T₀代基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以二倍体基因编辑作物T₀代的基因组DNA为模板DNA，在基因编辑靶标位点的上下游设计特异性引物，进行PCR扩增，将得到的PCR产物回收后纯化和第一次Sanger测序；当测序结果为单一峰图，则所述基因编辑作物T₀代的植株为纯合植株；当测序结果单一峰后面出现3个信号峰，则为嵌合体；单一峰后面出现2个信号峰，则为杂合体或双等位基因突变基因型；

(2)对于测序结果有杂峰或套峰的所述PCR产物进行T/A克隆，得连接产物；

(3)将所述连接产物转化感受态细胞，在LB培养基中震荡培养60min后，将菌液涂抹在含氨苄青霉素的LB平板上，培养8～12h，挑取单菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中震荡培养8h后，进行第二次Sanger测序；将测序结果用NCBIBlast工具，与野生型序列进行比对；基因编辑序列为三个不同的序列，则为嵌合体；基因编辑序列为两个不同的序列，则为双等位基因突变基因型；对应的两个序列，一个为野生型，一个为突变序列，则为杂合体基因型。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)中在基因编辑靶标位点的下游350～500bp处设计特异性引物。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，在得到所述特异性引物后，还包括利用所述特异性引物和阴性植株DNA进行PCR扩增，扩增条带单一；回收和纯化PCR产物后，进行第一次sanger测序，测序结果显示无杂峰。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)所述PCR扩增的体系以20μl计，包括：模板DNA 1μl，10mM dNTPs 0.5μl，所述特异性引物的上下游引物各0.5μl，10×ExTaqBuffer2μl，Ex Taq 0.1μl，加水补足至20μl。

5.根据权利要求1或4所述方法，其特征在于，步骤(1)所述PCR扩增的反应程序包括：94℃预变性2min；94℃变性30s，56℃退火50s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸5min。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)中测序结果仅为单一峰图，判定所述基因编辑作物T₀代的植株为纯合植株，包括双等位基因纯合突变或阴性植株后，还包括用NCBIBlast与野生型靶位点序列进行比对，来判断纯合基因型，如果和野生型序列一致，则为纯合阴性植株；如果不一致，则为双等位基因纯合突变。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)中利用CV21-ZeroBackgroundpTOPO-TA/Blunt Cloning Kit进行所述T/A克隆。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述T/A克隆的体系以10μl计，包括：pTOPO-Blunt Simple Vector 1μl，PCR产物1μl，10×Enhancer 1μl和灭菌水7μl。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述含氨苄青霉素的LB平板和含氨苄青霉素的LB培养基中氨苄青霉素的浓度均为100μg/ml。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述震荡培养和培养的温度均为37℃。