[发明专利]杀香鱼假单胞菌六型分泌系统缺失突变株及其应用

说明书

本发明涉及一株杀香鱼假单胞菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株，可以作为预防杀香鱼假单胞菌感染的减毒活疫苗，其中缺失了杀香鱼假单胞菌的3套六型分泌系统的部分效应元件基因，包括T6SS1、T6SS2和T6SS3。杀香鱼假单胞菌毒株是杀香鱼假单胞菌毒株NB2011，其保藏号为：CGMCC No.8985，杀香鱼假单胞菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株是ΔT6SS1‑3，其保藏编号为：CGMCC No.20416；还提供了其应用，本发明的减毒突变株消除了传统减毒活疫苗普遍存在的潜在返毒的环境和产品安全风险，是针对养殖大黄鱼内脏白点病的一种安全、有效、经济的疫苗。

技术领域

本发明涉及减毒突变株技术领域，特别涉及鱼用细菌性减毒活疫苗技术领域，具体是指一种杀香鱼假单胞菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变株、相关制剂及其应用。

背景技术

大黄鱼(Larimichthys crocea)是浙江、福建等东南沿海省份海水网箱养殖的重要经济鱼类品种，近年来受到内脏“白点病”的严重危害，该病一般在1-3月的低温季节暴发，感染鱼内脏器官如脾和肾等出现大小不一的白色结节，发病鱼基本不摄食，无法通过口服用药的方式进行有效治疗和控制，往往造成极高的死亡率。该病致病菌为杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)。目前生产中主要通过投喂敏感抗生素，如强力霉素、恩诺沙星等加以防控，但效果并不理想；并且，抗生素的反复、大量使用可能带来水产动物药物残留和环境中耐药菌的增加和传播问题，给人类的健康埋下隐患。

杀香鱼假单胞菌最早在日本淡水养殖的香鱼细菌性出血型腹水症(BHA)中分离，在2000年被鉴定为一新种。不同分离株在理化特性和血清型上表现出高度的统一性；不过，迄今仍无商业化的化学治疗药物投放市场。疫苗接种是预防细菌性感染的有效途径，世界范围内针对海水鱼类弧菌病、爱德华氏菌病、鲑科鱼类肠型红嘴病、淡水鱼类细菌性败血症等流行范围广、危害程度大的感染性疾病，已经开发出多种商品化疫苗，并获得成功应用。已有研究表明，以添加佐剂的灭活杀香鱼假单胞菌疫苗免疫大黄鱼，可以激发显著的免疫，但保护效果尚不理想；多位研究者观察到该菌在鱼体巨噬细胞中能够存活和增殖，提示了该菌具有兼性胞内病原菌的特性，预防该菌感染，需有效激发宿主的细胞免疫应答，对应的疫苗形式如减毒活疫苗、DNA疫苗等，可能发挥更好的免疫保护效果。

细菌分泌系统是菌体自身合成的，结合在细胞膜上，向外界分泌效应蛋白的巨型蛋白复合体，目前在革兰氏阴性菌中已经发现了Ⅰ-Ⅷ型共八套分泌系统，其中Ⅵ型分泌系统(T6SS)广泛存在于革兰氏阴性菌中，具有多功能性，包括在环境竞争中发挥对其它细菌的抗菌性能、对真核细胞的致病性，及参与对环境条件的适应等方面。

杀香鱼假单胞菌NB2011是自浙江省象山港养殖大黄鱼分离的内脏白点病致病菌，采用在线生物信息学工具对菌株NB2011的基因组分析发现，该菌编码了3套T6SS，每套系统的基因组成相似，均包含Hcp和VgrG、鞘蛋白vipA/vipB、结构蛋白TssA、TssJ、TssK、TssE、TssG、TssF和ATP酶clpV等(如图10所示)，但基因排列各有不同，简称为T6SS1、T6SS2、和T6SS3，以基因簇形式存在，分别分布在基因组的2.76Mb-2.79Mb、3.61Mb-3.65Mb和4.39Mb-4.43Mb区域，各含有8、10、12个核心基因。其中T6SS2与恶臭假单胞菌KT2440株的K1-T6SS相似，编码一DNA酶活性的毒力蛋白，主要在对抗环境细菌中起作用；T6SS1则与铜绿假单胞菌的H2-T6SS相似，可能在对宿主的致病性中起到重要作用；已有研究结果表明，T6SS1的缺失显著减弱了菌株的毒力，对大黄鱼的LD50明显增大；而T6SS2的缺失基本未改变菌株的毒力，但对其它革兰氏阴性菌的抑菌性能显著减弱，表明了T6SS1是杀香鱼假单胞菌的重要毒力因子，T6SS2则主要在抑制环境细菌中起到重要作用。

发明内容