[发明专利]一种胞磷胆碱钠的合成方法在审
| 申请号： | 202010895805.2 | 申请日： | 2020-08-31 |
| 公开（公告）号： | CN111808899A | 公开（公告）日： | 2020-10-23 |
| 发明（设计）人： | 何魁芳;胡东晓;马克·博科拉;蔡宝琴;张城孝;胡虎;罗霄;彭沁利;崔琴燕;刘思彤;余梦娇 | 申请（专利权）人： | 宁波酶赛生物工程有限公司 |
| 主分类号： | C12P19/30 | 分类号： | C12P19/30;C12N15/54;C12N9/12;C12N15/70 |
| 代理公司： | 浙江素豪律师事务所 33248 | 代理人： | 杨璇 |
| 地址： | 315000 浙江省宁波市鄞州区世纪大道北段*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 胆碱 合成 方法 | ||
1.一种胞磷胆碱钠的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
向反应容器中加入5'-胞苷酸，氯化磷酸胆碱钙盐，ATP，氯化镁水溶液，Tris-HCl缓冲液，混合均匀；接着，调节pH值至6.0～8.0，并加入CMP磷酸激酶、核苷二磷酸激酶和磷酸胆碱-胞苷酰转移酶，在25～50℃下搅拌反应4～10小时，高速离心后，取上清液，即得所述胞磷胆碱钠；
其中，所述CMP磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述核苷二磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的胞磷胆碱钠的合成方法，其特征在于，在反应体系中，所述CMP磷酸激酶、所述核苷二磷酸激酶和所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的浓度分别为1～50g/L。
3.根据权利要求1所述的胞磷胆碱钠的合成方法，其特征在于，在反应体系中，所述5'-胞苷酸的浓度为5～150mmol/L。
4.根据权利要求1所述的胞磷胆碱钠的合成方法，其特征在于，在反应体系中，所述氯化磷酸胆碱钙盐的浓度为15～200mmol/L。
5.根据权利要求1所述的胞磷胆碱钠的合成方法，其特征在于，在反应体系中，所述ATP的浓度为6～200mmol/L。
6.根据权利要求1所述的胞磷胆碱钠的合成方法，其特征在于，所述CMP磷酸激酶、所述核苷二磷酸激酶和所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的制备方法分别包括：
S1：将所述CMP磷酸激酶或所述核苷二磷酸激酶或所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶对应的基因克隆到pACYC-DUET1载体上，并转化到BL21(DE3)大肠杆菌的宿主细胞内；
S2：将克隆得到的酶的工程菌的种子接种到培养体系中，培养18-24小时，培养结束后离心收集菌体；
S3：取上述菌体悬浮在50mM Tris-HCl缓冲液中，破碎后，获得破碎液，将上述破碎液进行高速离心，即得到酶液上清。
7.根据权利要求6所述的胞磷胆碱钠的合成方法，其特征在于，在步骤S3中，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.5。
8.根据权利要求6所述的胞磷胆碱钠的合成方法，其特征在于，在步骤S3中，所述菌体质量与所述Tris-HCl缓冲液的悬浮比例为1:10～1:20g/mL。
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