[发明专利]用于检测基因融合的靶向测序方法

说明书

本发明一种用于检测基因融合的靶向测序方法，其包括提取样本的总RNA，反转录得到cDNA，然后片段化为150‑250pb的片段、并在末端修复、加A，连接测序接头，得到预文库；利用封闭阻断剂封闭预文库，然后使特定的探针组与预文库杂交，获得捕获片段，经PCR富集和纯化后质检，得到测序文库；利用二代测序对测序文库进行测序，获得基因融合信息。本发明的方法在使用更少的探针和更低的测序数据量时，仍然能够保持高的捕获效率，获得比传统捕获更多的阳性Reads，减少了探针合成和测序成本，提高了检测灵敏度。

技术领域

本发明涉及靶向方法，更具体地，本发明涉及一种用于融合基因检测的高通量靶向测序方法。

背景技术

通过染色体重排，例如异位、缺失、插入，癌细胞常常发生基因融合事件。随着对融合基因的临床重要性的认识日益增加，融合基因的精确诊断也越来越受到重视。目前，已有多种抑制融合基因的肿瘤靶向治疗药物，包括伊马替尼/BCR-ABL1、克唑替尼/EML4-ALK和拉罗替尼/NTRK融合等。

融合基因的快速、准确诊断不但可以对癌症进行诊断和分型，还能够为后续的治疗提供必要信息。目前，融合基因诊断主要包括荧光原位杂交(FISH)、IHC等方法，然而，这些检测方法的通量通常较低，依赖检验人员的经验，只适用于已知的融合亚型。有报道表明，使用IHC检测NTRK3融合的灵敏度降低，只有79％[Identifying patients with NTRKfusion cancer.]。

多种新兴的融合基因检测技术虽然避免了技术人员的主观判断，具有更高的通量和检测灵敏度，例如Nanostring(ncounter Vantage 3DTM Assays)和Agena MassArray，但它们都不能发现新的融合亚型[Overview of Fusion Detection Strategies UsingNext-Generation Sequencing]。此外，基于下一代测序的全转录组测序成本较高，且不能兼容临床样本、而多重扩增子靶向测序技术假阳性率较高、需要事先建立人群基线，利用生物信息学方法过滤低置信度的结果。

发明内容

针对现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种用于检测基因融合的靶向测序方法。与传统探针设计相比，本发明的探针与目标外显子区域具有更高的结合效率，同时探针数量更少，覆盖区间更小，成本更低。

本发明的用于检测基因融合的靶向测序方法，其包括以下步骤：

(1)预文库构建，其包括提取样本的总RNA，反转录得到cDNA，然后片段化为150-250pb的片段、并在末端修复、加A，连接测序接头，得到预文库；

(2)利用封闭阻断剂封闭所述预文库，然后使探针组与所述预文库杂交，获得捕获片段，经PCR富集和纯化后质检，得到测序文库；

(3)利用二代测序对所述测序文库进行测序，获得基因融合信息；

其中，所述探针组由能够与基因A各外显子的5’末端和/或3’末端互补的第一探针以及能够与基因B各外显子的5’末端和/或3’末端互补的第二探针组成。

根据本发明所述的靶向测序方法，优选地，5’末端是指外显子5’端第1个碱基至第120个碱基之间的片段，3’末端是指外显子3’端最后1个碱基至倒数第120个碱基之间的片段。

根据本发明所述的靶向测序方法，优选地，所述基因A为5’伴侣基因，且所述第一探针与所述5’伴侣基因的各外显子的3’末端互补；所述基因B为3’伴侣基因，且所述第二探针与所述3’伴侣基因的5’末端互补。

根据本发明所述的靶向测序方法，优选地，所述第一探针和所述第二探针分别为5’端生物素修饰的探针。

根据本发明所述的靶向测序方法，优选地，所述步骤(1)为利用总RNA进行文库构建，并不去除核糖体RNA。