[发明专利]直接力学响应细胞亚群的筛选方法及其应用

说明书

本发明公开了一种直接力学响应细胞亚群的筛选方法及其应用，筛选到的细胞亚群包括Fat4+亚群、Fgfr3+亚群和Scara5+亚群，同时公开了力学响应细胞亚群用于制备局部骨缺损修复再生及应力相关骨代谢疾病药物的应用。本发明通过单细胞测序技术筛选直接力学响应细胞，通过单细胞转录组水平进行应力刺激下的细胞基因表达谱的精细分析，寻找应力调控下发生命运变化的关键细胞亚群，并通过标记基因进行体外流式分选及体外应力加载，结合构建CreER‑loxP诱导型报告基因系统进行体内谱系示踪验证其力学响应性，从而达到鉴定直接力学响应细胞的目的。

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种直接力学响应细胞亚群的筛选方法及其应用。

背景技术

生物力学现象在机体多个器官与组织中广泛存在，如皮肤、心脏、肺泡、骨骼等。骨骼系统是保护支撑人体的“钢筋铁骨”，负责机体对应力刺激的承受、感知与转导。骨骼系统感受机械应力，通过对力学刺激的响应调整其结构以适应环境改变。牵引成骨、骨折修复、正畸牙移动、失重引发骨质疏松等诸多临床现象表明，机械应力是调控骨代谢与改建的重要因素。因此，从细胞分子层面揭示骨组织的力学响应机制是生物力学研究领域的重要前沿。阐明骨组织的力学响应机制对于筛选骨组织疾病生物力学干涉和基因辅助治疗的关键靶点具有重要意义。

目前已有诸多文献报道，应力刺激可促进骨组织细胞成骨向分化增强。然而，作为骨骼生理学的核心法则，骨组织内部直接感受并响应力学因素的细胞尚未得到定论。这是由于现有研究力学响应细胞技术的限制—多数研究采用直接对成骨细胞系如C3H10T1/2、MC3T3-E1或原代骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)进行体外应力加载的方法。但是细胞系无法反映原代细胞的力学响应情况；原代BMSCs则是包含多种分化状态、不同谱系分化倾向性、不同功能的混杂细胞群体，在应力作用下，不同BMSCs亚群会出现不同的响应状态及功能效应；除BMSCs外，也有学者认为骨骼系统内成熟的成骨细胞或骨细胞也可能是力学敏感细胞，而传统方法难以直接获得均质的原代成骨细胞、骨细胞，仍然无法明确混杂群体中的真正力学响应细胞。另一些研究则采用Cre-loxP系统构建模式动物进行谱系示踪以寻找力学响应细胞，然而由于Cre表达谱的复杂性以及多数细胞存在异质性，并不能精确鉴定出真正的力学响应细胞亚群。

细胞是机体的基本组成单位，机体的每一个细胞都具有其独特性。单细胞RNA测序(single-cell RNAsequencing，scRNA-seq)技术作为一项革命性工具，在揭示细胞独特性上达到了前所未有的精度。目前单细胞测序技术主要应用于肿瘤、免疫、发育、微生物等研究领域，多数研究通过对细胞进行单细胞转录组测序，重新定义细胞类型，即构建物种个体/器官/组织的单细胞图谱，或鉴定肿瘤分子标志物。然而，生物力学领域尚未见单细胞转录组水平的报道。基于单细胞测序在细胞异质性分析及拟时序分析的优越性，单细胞测序技术是否可以作为筛选直接力学响应细胞的有力工具，混杂的骨组织细胞群体中是否存在直接响应机械应力的细胞亚群，应力作用下其细胞命运又如何转归。

由于现有研究力学响应细胞技术的限制，骨组织内部直接感受并响应力学因素的细胞难以检测，因此尚未得到定论。现有技术主要分为体外应力加载及模式动物研究两大方法。①体外应力加载多数采用直接对成骨细胞系如C3H10T1/2、MC3T3-E1进行体外应力加载的方法，但是细胞系无法反映细胞在体内的力学响应情况。②另一些研究采用原代BMSCs加力，但BMSCs本身是包含多种分化状态、不同谱系分化倾向性、不同功能的混杂细胞群体，在应力作用下，不同BMSCs亚群会出现不同的响应状态及功能效应，无法鉴定出其中真正的力学响应亚群。③除BMSCs外，也有学者认为骨骼系统内成熟的成骨细胞或骨细胞也可能是力学敏感细胞，而传统方法难以直接获得均质的原代成骨细胞、骨细胞，仍然无法明确混杂群体中的真正力学响应细胞。④模式动物研究则采用Cre-loxP系统构建特异性荧光表达小鼠进行谱系示踪以寻找力学响应细胞，然而由于Cre表达谱的复杂性以及多数细胞存在异质性，并不能精确鉴定出力学响应细胞亚群。