[发明专利]一种牡蛎促进泌乳作用研究方法

权利要求书

1.一种牡蛎促进泌乳作用研究方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、实验材料

（1）牡蛎、母鼠和公鼠。

（2）本实验使用均为SPF级健康SD大鼠，母鼠和公鼠比例为2：1，且母鼠和公鼠均为8周龄未配种大鼠，SD母鼠的体重范围：180g～200g，SD公鼠的体重范围：200g～250g。

S2、主要实验试剂

硼酸、无水碳酸钠、无水乙醇、浓硫酸、浓盐酸、硫酸钾、葡萄糖、正丁醇、五水合硫酸铜硫酸钾、三氯乙酸、氯化钡、酒石酸钠、氢氧化钠、氯化钠、二甲苯、苏木精伊红染色剂、水合氯醛、乙酸锌、福林酚、牛血清蛋白。

S3、牡蛎粉的制取

（1）将新鲜的牡蛎利用清洗机或清洗池清洗干净，接着将清洗干净的牡蛎滤干，制粉。

（2）在20℃的温度下预冻，预冻3h后，便可放入-80℃超低温冰箱中深冻，对经过冷冻干燥的牡蛎粉进行干燥保存。

S4、牡蛎蛋白的制取

（1）牡蛎冻干粉50g溶于1L蒸馏水。

（2）0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至12～13。

（3）4℃下搅拌3小时，在10000r/min、4℃下离心15min，提取上层清液。

（4）0.1mol/L盐酸溶液调节上层清液pH至4.5～5.1，在10000r/min、4℃下离心15min，收集沉淀物。

（5）将沉淀物转入12ku孔纤维透析袋，透析48小时，收集沉淀，并冷冻干燥，进行干燥保存。

S5、牡蛎酶解粉的制取

（1）将新鲜的牡蛎清洗干净，并进行沥干、匀浆，匀浆∶水为1∶3加入蒸馏水，调节pH为7.0，加入动物蛋白水解酶。

（2）将1000U/g牡蛎肉在53℃水浴锅恒温6h，并以500r/min的速度离心20min，提取上清液，旋蒸除水，接着冷冻干燥，进行干燥保存。

S6、超负荷哺乳大鼠模型的建立

（1）调整每一窝母鼠所哺育的仔鼠数量，通过增加或减少仔鼠数量，使得每一窝仔鼠数量相同，母鼠哺乳同样数量的仔鼠，不能满足一窝仔鼠的摄食需要，为超负荷大鼠模型。

（2）平均分为正常组和牡蛎全粉组，正常组的灌胃蒸馏水，1mL/100g，每天一次，连续20天，牡蛎全粉组的同时灌胃0.8mg/mL牡蛎全粉溶液，每天一次，连续20天。

S7、血清采集和保存

实验结束后，所有母鼠麻醉，眼球取血于离心管中，37℃静置20min，置于高速离心机离心，温度4℃，3000r/min离心15min，收集上清液，于-20℃冰箱中冻存待测。

S8、样品检测

（1）取出血清样品解冻，试剂盒从冷藏环境中取出在室温平衡15-30分钟后使用。

（2）操作步骤：

标准品的稀释：

加样：分别设置空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤操作相同）、标准孔、待测样品孔，在酶标包被板上标准品准确加样50μL，待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL（样品稀释度为5倍），加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；

温育：使用封板膜封板后置37℃温育30分钟；

配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水3倍稀释后备用；

洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，拍干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次拍干；

加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外，温育，洗涤；

显色：每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色15分钟；

终止：每孔加入终止液50μL，终止反应（此时蓝色立转黄色）；

测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），测定应在加终止液后15分钟以内进行。

（3）数据处理

S9：乳腺组织结构观察

将麻醉后的母鼠仰卧置于解剖手术盘上，沿腹正中线切开胸腹部皮肤，分离胸腹部皮下的乳腺组织，称量并记录乳腺的重量，然后切取距乳腺顶端1cm的乳腺相同部位，放入大约10倍体积的4%中性多聚甲醛中固定24-72h，过两夜。

S10：组织蜡块制作

（1）固定组织修整与水洗

1、 先将组织块置于固定液中固定24h～72h，再取出组织块。

2、取出组织块后用手术刀修整形状，置于脱水框中做好标记，自来水流动清洗组织块2小时以上洗去固定液。

（2）组织脱水

将洗去固定液的组织块按照如下步骤置于梯度浓度酒精中，进行脱水：

50%乙醇：30min。

70%乙醇：30min。

80%乙醇：30min。

95%乙醇：30min。

无水乙醇Ⅰ：30min。

无水乙醇Ⅱ：40min。

（3）透明

将脱水完成后的组织块按如下步骤操作：

1、置于二甲苯：酒精1:1溶液：15min。

2、二甲苯Ⅰ：15min。

3、二甲苯Ⅱ：40min。

（4）浸蜡

将完全透明后的组织块取下脱水篮，将石蜡融化后将组织块按以下步骤浸蜡，石蜡温度在64℃左右，根据石蜡形态调整温度。

1、石蜡：二甲苯1:1混合 ：30min。

2、石蜡Ⅰ：1h。

3、石蜡Ⅱ：1h。

4、石蜡Ⅲ：1h。

（5）组织包埋

将浸好的组织块置于包埋盒中，将融化好的包埋石蜡注入包埋盒中，让石蜡完整包裹住组织块，同时避免石蜡凝固后与包埋盒有缝隙。

（6）修整蜡块

将包埋盒置于通风处待蜡液完全凝固，凝固后将包埋盒放入冰箱中-20℃冷冻30min。

冷冻完成后，小心取出蜡块，先在蜡块一侧做好清晰的组织标记，然后用刀片切除组织块周围的石蜡，组织块周围要保留1～2mm的石蜡，蜡块修整为正方形。

S11：制作组织切片

（1）切片

蜡块固定在支持器上，蜡块与刀片形成5°夹角，将蜡块切片，蜡块切片内组织切面要完整光滑，再将刀片向左移动约一个蜡块宽度的距离，调节切片厚度为5μm，再进行切片，切片连续呈带状，完整均匀。

（2）展片

预先将烘片机46℃预热，在洁净的载玻片上滴加少量蛋清，同方向抹匀，然后滴加几滴蒸馏水，再将蜡片小心夹取到载玻片上，最后将载玻片置于烘片机上烘干。

（3）组织切片的脱蜡和水化

完全烘干的组织切片置于玻片架上，按如下步骤脱蜡：

1、二甲苯Ⅰ：5min。

2、二甲苯Ⅱ：5min。

3、1/2二甲苯+1/2无水乙醇溶液：5min。

脱蜡完成后，将组织切片按如下步骤洗脱二甲苯：

1、无水乙醇：2min。

2、95%乙醇：2min。

3、90%乙醇：2min。

4、80%乙醇：2min。

5、70%乙醇：2min。

6、蒸馏水浸洗：2min。

将脱蜡后的组织切片依次放入梯度浓度的酒精中，按照无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇的顺序脱去二甲苯，每个浓度的乙醇浸泡2min，最后用蒸馏水浸洗2min。

（4）组织切片的苏木素染色

首先将组织切片上的蒸馏水甩干，然后将组织切片浸泡在苏木素染液中染色4min，最后蒸馏水浸洗2min，在低倍显微镜下观察染色结果，若细胞核染色不清晰，重复之前步骤，直至染色清晰。

（5）组织切片的伊红染色

将苏木素染色完成后的组织切片按如下步骤脱色：

1、70%乙醇：2min。

2、80%乙醇：2min。

3、95%乙醇：20min。

4、100%乙醇Ⅰ：2min。

脱色完成后，将组织切片置于95%乙醇和0.5%伊红染液混合溶液中浸泡染色12min，再按如下步骤洗脱。

1、95%乙醇：2min。

2、无水乙醇Ⅰ：2min。

3、无水乙醇Ⅱ：2min。

4、1/2二甲苯+1/2乙醇：2min。

5、二甲苯Ⅰ：10min。

6、二甲苯Ⅱ：10min。

（6）组织切片的封片

将染色后的载玻片从二甲苯中取出，在其表面液体未干的情况下立即滴加中性树胶盖上盖玻片进行封片。

（7）观察组织切片

玻片置于显微成像系统进行观察，拍照保存。

S12：样品分析

S13：数据处理和结果判定

实验组和对照组比较差异有显著性，可判定该受试样品促进泌乳功能作用动物实验结果阳性。