[发明专利]miR-155作为标志物在鉴定或辅助鉴定动物精液品质中的应用

说明书

本发明公开了miR‑155作为标志物在鉴定或辅助鉴定动物精液品质中的应用。检测待测动物个体SPEVs中miR‑155的表达量，如果待测动物个体SPEVs中miR‑155的表达量高于对照动物个体SPEVs中miR‑155的表达量，则动物精液品质为不良；如果待测动物个体SPEVs中miR‑155的表达量不高于对照动物个体SPEVs中miR‑155的表达量，则动物精液品质为良好；对照动物个体为精液品质优良的动物个体。因此，仅通过检测动物个体SPEVs中miR‑155的表达量就可以鉴定动物精液品质。本发明对建立精液品质优良的群体具有重大的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及miR-155作为标志物在鉴定或辅助鉴定动物精液品质中的应用。

背景技术

RNA-seq技术即转录组测序技术，为一种借助二代高通量测序方法对细胞或组织中的总RNA进行测序的技术。RNA-seq技术可以对细胞或组织中基因的表达情况进行检测，同时可以通过与参考基因组序列的比对检测到群体中存在的重要遗传变异。目前，RNA-seq技术已经广泛应用在动植物重要经济性状的研究中。

优良种公猪是养猪业中发展最重要的因素之一，公猪精液质量的优劣直接影响了猪场的经济效益。当前，人工授精技术在猪养殖生产中的应用越来越广泛。在世界许多养猪国家，人工授精已经是商品母猪繁殖的主要形式。利用人工授精技术不但可以加速群体的遗传改良，将优良基因扩展到更多的养殖场中，而且可以大幅提高劳动效率，降低养殖成本。而选择具有优良精液品质的种公猪则是实施人工授精的前提和保证。传统方法很难快速准确的选择精液质量，但通过分子标记进行辅助选择(Marker assisted selection，MAS)可以有效的加快育种进程，选留优势群体，淘汰劣势公猪，提高公猪精液品质性状。

细胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)是一种细胞主动释放的由脂质双分子层包围的球形膜性囊泡，直径在30-4000nm，包括微囊泡(microvesicles，MV)、凋亡小体(apoptotic body)和胞外囊泡(exosome)、迁移体(migrasome)等。精浆中含有大量的胞外囊泡。前列腺是精浆胞外囊泡主要的分泌器官，也来源于附睾和其他副性腺等多个组织和器官，所以近年来把精浆中的这些成份复杂的胞外囊泡统称为精浆胞外囊泡(seminalplasma extracellular vesicles，SPEVs)。自SPEVs首次被发现以来，关于它功能的研究就从未停止。研究发现，SPEVs可以参与到顶体反应中，帮助精子在正确的时间点获能，有学者认为此功能是通过诱导精子酪氨酸磷酸化来实现的，也有研究发现SPEVs可以保护精子免于雌性生殖道的免疫反应，这对于精子成功穿过透明带并与卵子结合非常重要，有人推测该功能可能与其中的非编码RNA有关。SPEVs还可以促进精子活力，这一作用已被多个研究团队证实，而且在不同的物种中也得到了验证，有人推测这一功能可能是通过调节精子微环境中一些二价阳离子如钙、锌和镁的浓度从而调控精子鞭毛的摆动来实现的。还有研究表明SPEVs中的一些小的非编码RNA可以与雌性生殖道的靶细胞结合从而影响相关基因表达。关于SPEVs内容物的研究也是层出不穷，目前研究最广泛的包括蛋白质和小的非编码RNA(如microRNAs、YRNAs、tRNAs)，很多研究集中在“比较组学”方面，目的是挖掘SPEVs中某些物质作为某些疾病如一般不育症、梗阻型和非梗阻型无精子症、弱精子症、前列腺癌等疾病的生物标记，使疾病的诊断更加快速且无创。Abu-Halima等通过对12名正常男性和12名少精症患者的SPEVs中microRNAs进行测序分析，共鉴定到36个差异表达microRNAs，qPCR验证结果显示SPEVs中miR-765和miR-1275的表达在弱精子症患者中明显升高，miR-15a的表达明显降低。Barceló等分析了正常男性、生精障碍导致的无精子症以及梗阻型无精子症患者三组样本间SPEVs中microRNAs的表达谱，发现不仅可育男性和不育男性之间microRNAs表达有差异，生精障碍型和梗阻型无精子症男性之间也有差异。Murdica等人用正常男性、弱精症患者、输精管结扎后无精男性的SPEVs与正常男性的精子共孵育，发现精子在体外仍然可以与SPEVs结合，与Du的研究结果一致。正常和输精管结扎男性的SPEVs可以影响精子运动和获能，增加精子活力并且促进顶体反应，弱精症患者的SPEVs导致精子活力降低，作者推测富含半胱氨酸的分泌蛋白1从SPEVs转移到精子可能在这些现象中起作用。2013年，Lidia等探究了猪的SPEVs在猪精子获能过程中的作用，发现其可以抑制猪精子获能所特有的14-kD磷酸化信号的消失，抑制获能过程中顶体胆固醇的损失和流动性的增加。Du等的研究发现猪的SPEVs可以在体外与成熟精子结合，并且可以促进精子运动、维持顶体完整性。