[发明专利]一种表达猪塞内加谷病毒蛋白的细胞系、构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种表达猪塞内加谷病毒蛋白的细胞系、构建方法和应用，所述细胞系包含猪塞内加谷病毒3A基因，并且能够稳定表达猪塞内加谷病毒3A蛋白；所述构建方法包括3A基因的扩增、重组慢病毒载体pLV/3A的构建、293T细胞的培养和细胞系的构建步骤。本发明细胞系能够稳定高效表达猪塞内加谷病毒蛋白，可用于制备猪塞内加谷病毒疫苗。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种表达猪塞内加谷病毒蛋白的细胞系、构建方法和应用。

背景技术

猪塞内加谷病毒(SVV)属于小核糖核酸病毒科Senecavirus病毒属成员，可引起猪鼻镜及蹄冠处出现水疱、溃烂创面从而导致跛足甚至死亡。SVV为无囊膜的单股正链RNA病毒，基因组编码5个结构蛋白L、VP1、VP2、VP3和VP4，编码7个非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。L、VP1、VP2、VP3和VP4在SVV结构组装中发挥重要作用，2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D在SVV复制和转录中发挥重要作用。目前关于用慢病毒技术稳定表达3A蛋白仍未见报道。

公告号为CN110279855B的中国专利公开了一种免疫组合物，其包含：猪塞内卡病毒结构蛋白VP3和VP1蛋白，以及，猪塞内卡病毒结构蛋白VP2和/或VP4蛋白。进一步的，所述免疫组合物还可包括猪塞内卡病毒结构蛋白VP0。所述免疫组合物可用于制备猪塞内卡病毒新型基因工程亚单位疫苗，该疫苗的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对动物没有致病性，并且该疫苗可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成本。但是，该专利只是评价病毒结构蛋白的免疫原性，没有考虑病毒非结构蛋白在机体免疫反应中的重要作用。

公开号为CN110358741A的中国发明专利申请公开了一种表达猪塞内卡病毒VP2基因的重组杆状病毒及其制备方法与应用。该发明提供一种重组杆状病毒，其包含一个或多个拷贝的猪塞内卡病毒VP2蛋白的编码基因。该发明还提供猪塞内卡病毒亚单位疫苗，其包含采用所述重组杆状病毒表达的猪塞内卡病毒VP2蛋白。该发明通过人工密码子优化，实现了猪塞内卡病毒的VP2蛋白的高水平、高纯度表达，最大程度地保留了VP2蛋白的免疫原性。该发明提供的猪塞内卡病毒亚单位疫苗具有优异的免疫原性和高度的安全性，对猪塞内卡病毒的感染发挥理想的免疫保护效果。但是，该专利只能用一种特定细胞和特定培养基培养，增加了生产成本。

发明内容

为克服上述缺陷，本发明的目的在于提供表达猪塞内加谷病毒蛋白的细胞系、构建方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种表达猪塞内加谷病毒蛋白的细胞系，所述细胞系包含猪塞内加谷病毒3A基因，并且能够稳定表达猪塞内加谷病毒3A蛋白。

优选地，所述3A基因的序列如SEQ ID NO.1所示；所述3A蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

一种上述的表达猪塞内加谷病毒蛋白的细胞系的构建方法，包括以下步骤

S1、3A基因的扩增；

S2、重组慢病毒载体pLV/3A的构建：

a.双酶切3A基因与pLV质粒

b.3A基因与pLV连接

反应体系为：10*Buffer：2μL；T4-DNA-Ligase：1μL；3A基因：1.05μL；pLV：3.14μL；ddH₂O：12.81μL；反应条件为：PCR仪16℃连接6h；

c.转化感受态细胞

将步骤b得到的连接液加入到DH5α感受态细胞中，在不含Amp+抗性的LB液体培养基，37℃摇床培养1h，最后分离涂板；

d.挑菌