[发明专利]用于高效检测新型冠状病毒的RAA-CRISPR扩增引物组、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了用于高效检测新型冠状病毒的RAA‑CRISPR扩增引物组、试剂盒及方法，所述引物组为包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和/或SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5的核酸序列，或与其同源性大于90％的核酸序列；方法包括，采用进行新型冠状病毒的核酸扩增；向扩增后的产物中加入crRNA、T7转录酶、NTP、探针和缓冲液制成检测液；检测所述检测液的荧光强度，根据荧光曲线判断样品中是否含有新型冠状病毒；本发明提供了可代替荧光PCR方法，成为更加廉价、高效、应用范围广的检测新型冠状病毒的方法、扩增引物及试剂盒。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及用于高效检测新型冠状病毒的 RAA-CRISPR扩增引物组、试剂盒及方法。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)传播方式多样。目前已有证据表明，新型冠状 病毒的传播方式包括飞沫传播和接触传播等。而动物及其产品在运输、屠宰、加 工和储存等过程中被新型冠状病毒感染或者污染的可能性极大。现有研究认为新 型冠状病毒来源于蝙蝠，也有证明穿山甲体内发现的冠状病毒与SARS-CoV-2的 相似性高达85.5％-92.4％，穿山甲也被认为是SARS-CoV-2的中间宿主。可见， SARS-CoV-2具有广泛的宿主，是一种新发现、传染性强、危害大的人兽共患性 传染病。

新型冠状病毒目前的检测方法主要是基于PCR方法检测病毒的核酸以及免 疫学方法检测患者的抗体。但是PCR和实时荧光PCR需要特定温度循环的扩增 仪器，不便于实现现场检疫。目前应用广泛的恒温扩增技术如环等温扩增技术 (Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)与重组酶介导等温核酸扩 增技术(Recombinase AidedAmplification)等可以满足现场检测的需求。但 是也有证明LAMP存在特异性方面的缺陷，容易导致假阳性。张锋等也证明，重 组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase AidedAmplification，RAA)对引物 的设计非常敏感，需要从多对引物中筛选才能达到高灵敏度检测的要求。此外， 血清学检测方法也有一定的局限性。目前血清学检测方法是检测患者感染早期血 清中的IgM或IgG，但是也有研究证明IgM通常在感染5天以后出现，IgG通常 在感染10天以后出现，并且感染的早期抗体水平比较低，容易出现漏检或者非 特异性结合。因此，目前确诊仍然需要通过荧光PCR方法。

但是荧光PCR需要价格昂贵的荧光PCR仪，且检测环境要求高。不利于大范 围推广。因此，现有技术还缺少一种高效、低成本、操作便捷的新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)检测试剂盒及其方法。

猪流行性腹泻病毒(PEDV)属于冠状病毒科、冠状病毒属。到目前为止， 还没有发现本病毒有不同的血清型。本病毒对乙醚、氯仿敏感。病毒粒子呈现多 型性，倾向圆形，外有囊膜。从患病仔猪的肠灌液中浓缩和纯化的病毒不能凝集 家兔、小鼠、猪、豚鼠、绵羊、牛、马、雏鸡和人的红细胞。

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染可导致猪传染性胃肠炎，该病是一种急 性、接触性传染病，TGEV可引起仔猪肠黏膜上皮细胞发生变性、死亡，造成肠 道水、电解质代谢紊乱，营养吸收障碍，从而引起仔猪腹泻、脱水、营养流失、 甚至死亡。猪传染性胃肠炎主要呈地区性流行，各个品种及不同年龄段猪均对本 病易感，但最主要的发病群体是新生仔猪。调查发现对两周龄以下仔猪的致死率 高达100％。

犬冠状病毒(CCV)为单链RNA病毒，有6～7种多肽，其中4种是糖肽， 其不含RNA聚合酶及神经氨酸酶，可使犬发生程度不同的胃肠炎症状。特征有 频繁呕吐、腹泻、沉郁、厌食等症状。

猫冠状病毒(FCV)分为两个生物型，猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)和猫肠 道冠状病毒(FECV)。FECV在猫肠道中普遍存在，感染FECV的猫可产生轻微 的肠道症状，能够自愈，死亡率低。感染FIPV的猫可患致死性疾病FIP，该病 以浆膜炎、系统性炎症和肉芽肿样病变为主要特征。