[发明专利]一种检测免疫球蛋白G4时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法

说明书

本发明公开了一种检测免疫球蛋白G4时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法，属于免疫检测分析技术和纳米生物技术领域，在所述试剂盒中，包括集成在试剂条上的反应缓冲液、清洗液、增强液、包被IgG4抗体的磁微粒溶液、铕标记的IgG4抗体溶液，还有2瓶IgG4的校准品。上述试剂盒可以提供一种接近均相的反应体系，检测IgG4的含量，缩短检测时间，提高了效率，为临床使用提供便利。

技术领域

本发明属于免疫检测分析技术和纳米生物技术领域，具体涉及一种基于免疫球蛋白G4(IgG4)时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法。

背景技术

免疫球蛋白G是血清中含量最高的免疫球蛋白，它是血液和细胞外液中的主要抗体成分，发挥重要的免疫学作用。在人体中IgG可按重链氨基酸分为4 种亚型，分别为IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。在血清中，虽然IgG4的含量在4种亚型中最低(占1％-7％)，尽管如此，IgG4与某些疾病的关联却越来越被重视。2001年，日本学者Hamano等发现，自身免疫性胰腺炎AIP患者血清IgG4 水平显著升高，且在AIP的胰腺组织中有大量IgG4阳性浆细胞浸润，该类患者使用糖皮质激素(Glucocorticoids，GCs)后症状得到改善，血清IgG4水平降低。2003年首次由Kamisawa等提出了IgG4系统性疾病的概念，随着研究的深入，此后多部位的类似疾病如硬化性胆管炎、间质性肺炎、肾炎、腹膜后纤维化、炎性假瘤等陆续被发现，亦可在头颈部如涎腺、颌下腺、腮腺及脑下垂体等部位发生，虽然病变部位不同，但是病灶部位浆细胞均高表达IgG4，表现为慢性纤维性炎症，血清中均有IgG4升高及高滴度自身抗体等共同特征。因此在2010 年IgG4-RD作为一种新的临床疾病实体被宣布确立，将其正式命名为IgG4相关性疾病(IgG4-RD)日益得到医学界关注。

IgG4相关疾病在60岁左右老年男性患者最为常见，但随着对疾病认识的逐渐深入，发现除了老年人，儿童、青壮年和女性都有可能患IgG4相关疾病。此外，IgG4相关疾病的发生，还可能与体内的激素水平变化有关。IgG4相关疾病是一种与IgG4淋巴细胞密切相关的慢性、系统性疾病，该疾病以血清IgG4水平升高以及IgG4阳性细胞浸润多种器官和组织为特征，常见受累器官包括泪腺、胰腺和腹膜后间隙等，累及的器官或组织由于慢性炎症及纤维化进程可导致弥漫性肿大。

时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)进行IgG4的检测。TRFIA是一种以镧系元素螯合物为标记物的新兴技术，具有零本底、线性范围宽、稳定性好等特点，灵敏度可达到10^-18mol/L，较ELISA、CLIA、 ECLIA等的10^-9～10^-15mol/L更高，TRFIA的主要创新内容在于应用荧光强度大、衰变时间长、分子量小的镧系原子标记免疫分子，而不是常用的大分子的酶或放射性同位素，故建立的免疫方法灵敏度和量程成倍增加，而且没有放射性污染。时间分辨荧光免疫分析技术标记离子的荧光是类线光谱，其特点是激发光波长范围较宽而发射光谱峰范围较窄，这样有利于降低本底的荧光强度，提高检测的分辨率；在时间分辨荧光免疫分的激发光和发射光之间存在较大的 Stokes位移，这有利于排除非特异荧光的干扰，从而增强了测量的特异性；标记离子螯合物产生的荧光强度高，寿命长，这有利于消除样品及环境中非特异荧光物质对检测结果的影响；每一次检测都要重复进行1000次，取平均的荧光计数值作为结果，从而提高了检测的准确性。TRFIA是国内外免疫分析的主要发展方向之一。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本专利通过将TRFIA与磁微粒技术相结合，将所有试剂集成在一个试剂条上，建立IgG4-TRFIA方法，该检测可由全自动设备操作，准确的高，单人份检测，使用方便，将此技术应用于免疫功能及免疫疾病的研究，可以更准确的鉴别诊断硬化性胆管炎、间质性肺炎、肾炎、腹膜后纤维化、炎性假瘤，以通过方便的血清学检查进行IgG4相关疾病疗效评估。为IgG4相关疾病的诊断和治疗提供一个非常便捷的新手段。