[发明专利]一种大黄鱼虹彩病毒的双重TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒及制备方法

说明书

本发明以大黄鱼虹彩病毒LYCIV中的ORF021R和ORF129R保守区序列作为扩增靶序列，设计合成了两对特异性引物及对应的TaqMan探针，建立了LYCIV双重TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法，并开发成简便、快速、实用的检测试剂盒。

技术领域

本发明涉及大黄鱼虹彩病毒的检测方法，特别涉及大黄鱼虹彩病毒（LargeYellow Croaker Iridovirus，LYCIV）的双重TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒及制备方法。

背景技术

大黄鱼虹彩病毒（Large Yellow Croaker Iridovirus，LYCIV）是虹彩病毒科细胞肿大病毒属的成员，夏季高水温期为大黄鱼虹彩病毒病主要流行季节，高发期水温25℃-28℃，该病主要危害体长10cm左右的当年春苗，蔓延迅速，半个月内死亡率可达30%-50%。对于病毒性疫病，尚没有特效的治疗方法，病毒的早期检测和诊断仍是最重要的防治手段。因此，建立快速灵敏实用的大黄鱼虹彩病毒PCR检测技术，不仅有助于及时对大黄鱼虹彩病毒进行诊断、监控和防治，减少经济损失，而且也是今后加强科学养殖管理，建立苗种检疫体系所必须的。

目前，对大黄鱼虹彩病毒的检测主要采用透射电镜（Transmission ElectronMicroscope，TEM）观察和常规聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）检测等技术方法。但这些方法有的耗时长，操作繁琐，有的准确度不高，灵敏度低。而TaqMan探针法荧光定量PCR技术巧妙的利用了PCR技术的DNA高效扩增、TaqMan探针与DNA模板的高特异性杂交和光谱技术的敏感性及定量分析的优点，选用双重探针可以同时检测病原的2个基因片段的特异性位点，相较单探针具有更高的准确性和特异性，尤其在鉴别同属近缘不同病毒时更具优势，克服了单探针法在检测同属近缘病毒时可能存在的假阳性及常规PCR检测准确度不高和灵敏度低的不足，极大地提高了检测的准确性、特异性和灵敏性。当前，荧光定量PCR技术已广泛应用于各种病毒的检测，如呼吸道合胞病毒、副流感病毒、肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒等，但还未见双重TaqMan探针法荧光定量PCR应用于大黄鱼虹彩病毒检测的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性高，简便快捷的大黄鱼虹彩病毒的双重探针法荧光定量PCR检测试剂盒及制备方法。

本发明所述大黄鱼虹彩病毒的双重TaqMan探针法荧光定量PCR检测试剂盒设有盒体、裂解液、吸附液、洗涤液、荧光定量PCR反应液、阳性对照和阴性对照。

所述裂解液的配方为：终浓度5mol/L盐酸胍，0.1mol/L EDTA，去离子水定容至1L，pH为8.0。

所述吸附液的组成为玻璃粉、浓硝酸与水，所述玻璃粉、浓硝酸与水的配比为1g：（5-6）mL：（10-12）mL，其中玻璃粉以质量计算，浓硝酸和水以体积计算，所述浓硝酸的质量分数可为55%-70%。

所述洗涤液的配方为：终浓度0.1mol/L 氯化钠，1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCl，去离子水定容至1L，pH为7.5，再加入等体积的无水乙醇。

荧光定量PCR反应液的配方为：每19μL中包含2×定量PCR预混液10μL（TaKaRaPremix Ex Taq (probe PCR）），正向引物F1 0.4μL，F2 0.4μL，反向引物R1 0.4μL，R2 0.4μL，荧光探针Q1 0.2μL，荧光探针Q2 0.6μL，双蒸水6.6μL；所述正向引物和反向引物的序列为：

正向引物F1（SEQID NO:1）5’-CTGAGGGTGGTCGTCTGGTT-3’

正向引物F2（SEQID NO:2）5’-CAACCACCTGCCGGTTACAG-3’

反向引物R1（SEQID NO:3）5’-ATGGCGACCCTGCTACTTCT-3’