[发明专利]一种稳定高表达蛋白的单拷贝细胞株的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种稳定高表达蛋白的单拷贝细胞株的构建方法，其特征在于，所述方法基于293T细胞的可以快速精确插入且能稳定高水平表达目的基因；所述方法包括如下步骤：

(1)通过将含有可替换基因盒的anti-TNFα抗体表达质粒随机整合至293T细胞的基因组中，流式分选富集获得稳定高水平表达anti-TNFα单链抗体的293T-anti-TNF细胞；

(2)转染pFRT-EGFP-LoxP替换质粒pCDFGL替换展示在细胞膜表面的anti-TNFα单链抗体基因，第一轮重组替换，即Replace 1；替换成功的细胞会表达GFP从而自发绿色荧光，经过多轮的流式分选富集只表达GFP的细胞，命名为293T-GFP；

(3)用pFRT-RFP-LoxP替换质粒pFRL去替换细胞中的GFP基因，第二轮重组替换，即Replace2；多轮的流式分选富集只表达RFP的细胞，命名为293T-RFP；

(4)利用96孔板单细胞分选筛选出稳定高表达蛋白的优异单细胞克隆；

(5)获得优异克隆后，基于细胞株插入基因框的可替换性，将携带有外源基因的替换质粒pFRT-Ab-LoxP等准确插入到基因框中进而稳定表达目标蛋白进行后续研究，第三轮重组替换，即Replace 3；

在步骤(1)中，转染pCDNA3.1-hygro-SV40-DHFR-SV40 polyA-FRT-TNF-Loxp表达质粒pCD至前一天种下的293T细胞中；第二天加入100μg/mL浓度的hygromysin B抗生素筛选一周，然后在不含有hygromycin抗生素的培养基中培养一段时间使其稳定生长；未成功转染质粒的293T阴性细胞因为不具有hygromysin B抗性在抗生素筛选下逐渐死亡，加压后存活下来的细胞因成功转染质粒其细胞膜上有大量anti-TNFα单链抗体分子的表达，稳定培养一段时间后通过流式细胞仪将稳定高水平表达抗体分子的细胞群体分选下来，命名为293T-anti-TNF细胞，用于后续的多轮重组替换以增加获得单拷贝细胞株的机率；

在步骤(2)中，将pFRT-EGFP-LoxP替换质粒pCDFGL和重组酶质粒pF2AC共转293T-anti-TNF细胞，在Flp和Cre酶的共同作用下使GFP基因替换细胞中的anti-TNFα抗体基因；替换成功的细胞转录表达GFP蛋白，从而自发绿色荧光；流式分选只表达GFP荧光的细胞，命名为293T-GFP；将分选回来的293T-GFP细胞在无抗生素压力下经长时间扩大培养后继续进行了两轮流式分选，每轮分选富集0.5％的GFP荧光最强的细胞，直至检测不到标记anti-TNFα抗体的荧光信号，目的是获得蛋白表达水平更高且表达更为稳定均一的优势细胞群体；

在步骤(3)中，将pFRT-RFP-LoxP替换质粒pFRL和重组酶质粒pF2AC共转293T-GFP细胞，在Flp和Cre酶的共同作用下RFP基因替换掉细胞中的GFP；替换成功的细胞转录表达RFP蛋白使得细胞自发红色荧光；流式分选富集只有RFP荧光的细胞，命名为293T-RFP；将分选回来的293T-RFP细胞在无抗生素压力下经长时间扩大培养后继续进行了两轮流式分选，每轮分选富集0.5％的RFP荧光最强的细胞，直至检测不到GFP荧光信号；在步骤(4)中，通过两轮的流式分选富集最强RFP荧光信号后，进行96孔板单细胞分选，每个孔仅分选一个细胞，一共分了3个96孔板；待96孔板中的细胞培养生长一周后，显微镜下逐个观察将孔中有多个细胞克隆生长，或没有分选到细胞的孔，或单克隆细胞生长状态不好的排除在外，剩下生长状态良好的单克隆细胞株存活进行编号；待上述单克隆细胞株培养扩增后，流式检测每个单克隆表达RFP信号的均一度和稳定性，从中挑选出排名靠前的数个单克隆细胞株进行后续实验；

在步骤(5)中，将pFRT-外源蛋白-loxP替换质粒和pF2AC重组酶质粒共转上述步骤获得的单克隆细胞株，在重组酶的作用下细胞中的RFP被外源基因替换；流式分选细胞表面展示有外源蛋白的293T单克隆细胞；

所述外源蛋白为ADORA2A蛋白，所述ADORA2A蛋白为包含有信号肽、FLAG标签和跨膜序列的重组基因SP-ADORA2A-FLAGTM所编码的蛋白。

2.根据权利要求1所述方法制备和筛选的稳定高表达蛋白的单拷贝细胞株，所述单拷贝细胞株为权利要求1的步骤(4)得到的单拷贝细胞。

3.权利要求2所述的稳定高表达蛋白的单拷贝细胞株在重组蛋白表达中的应用。