[发明专利]特异性靶向Pd-l1基因的sgRNA及其应用

说明书

本发明公开了特异性靶向Pd‑l1基因的sgRNA及其应用，本发明公开了具有较高切割活性以及特异性的sgRNA，本发明同时公开了构建敲除PD‑L1的细胞的方法及由该方法构建的细胞株；本发明同时还公开了包含sgRNA或其表达载体的药物组合物。

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及特异性靶向Pd-l1基因的sgRNA及其应用。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，随着其诊断和治疗手段不断改善，患者的生存率有了明显提高。但三阴性乳腺癌作为最难治疗的乳腺癌亚型之一，仍然严重威胁着患者的生命健康。三阴性乳腺癌是指雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体均为阴性的乳腺癌，约占乳腺癌的15％～20％，其恶性程度高、缺乏有效的早期诊断和病程监测标志物、缺少特异性治疗靶点且预后不良(Chavan SS,Pavlov VA,Tracey KJ.Mechanisms andTherapeutic Relevance of Neuro-immune Communication.Immunity.2017.46(6):927-942；Pavlov VA,Chavan SS,Tracey KJ.Molecular and Functional Neuroscience inImmunity.Annu Rev Immunol.2018.36:783-812)。超过三分之一的三阴性乳腺癌患者会出现远处转移(Jensen DD,Lieu T,Halls ML,et al.Neurokinin 1receptor signaling inendosomes mediates sustained nociception and is a viable therapeutic targetfor prolonged pain relief.Sci Transl Med.2017.9(392).)，远处转移是患者死亡的主要原因之一，肺脏是乳腺癌最常见的转移部位。

现今，在肿瘤临床治疗中，使用阻断免疫细胞表面的免疫检查点抗体进行的免疫治疗是常用的治疗手段。免疫检查点(Immune Checkpoints)是调节系统性免疫稳态与耐受的信号通路。诸多研究表明，肿瘤细胞表面高表达免疫检查点配体，通过结合免疫细胞的免疫检查点达到抑制肿瘤免疫的效果。这一效果在肿瘤抗原特异性的效应T细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)的肿瘤抑制中尤为突出。特定的免疫检查点的阻断，比如PD-1，能够增强抗肿瘤免疫反应。但是，利用免疫检查点抗体的治疗并非对所有癌症均有效果。有些恶性肿瘤虽然过表达PD-L1，但对抗PD-1/PD-L1抗体治疗不敏感(Llorián-Salvador M,Pevida M,González-Rodríguez S,et al.Analgesic effects evoked by aCCR2 antagonist or an anti-CCL2 antibody in inflamed mice.Fundam

Clin Pharmacol.2016.30(3):235-47.)，且还存在抗体药物作用的短效性、免疫检查点的多样性、药物研发时间过长、抗体价格昂贵等诸多不利因素。

设计和制备出具有精确性和特异性靶向免疫检查点基因的sgRNA，敲除表面免疫检查点相关基因，为实现肿瘤免疫治疗提供了一种新的策略。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供靶向Pd-l1基因的sgRNA及其在敲除Pd-l1基因以及构建敲除PD-L 1基因的细胞中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了特异性敲除Pd-l1基因的sgRNA，所述sgRNA的序列包括SEQ ID NO.1-12所示的序列的任意一种或几种。

进一步，所述sgRNA的序列包括SEQ ID NO.1～4所示的序列。

本发明的第二方面提供了一种包含本发明第一方面所述的sgRNA的表达载体。