[发明专利]半乳糖基转移酶GalT基因点突变小鼠模型的构建方法及其用途

说明书

本发明提供了一种半乳糖基转移酶GalT基因点突变小鼠模型的构建方法及其用途，包括如下步骤：（1）靶点构建：寻找半乳糖基转移酶B4GalT基因的CDS区，明确外显子部分，确定基因突变位点；（2）获取受精卵，并进行显微注射：通过体外转录的方式，获得cas9 mRNA和gRNA，通过合成获得oligo donor DNA，将cas9 mRNA、gRNA和oligo donor DNA显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠；（3）将阳性F0代小鼠和C57BL/6J配繁后，得到具有B4GalT基因定点突变的阳性F1代杂合子；（4）阳性杂合子小鼠交配后经PCR测序确认获得阳性纯合子，表明小鼠模型构建成功。本发明模型制作简单，重复性好，可用于人类糖基化异常疾病的药物的研究，对探求治疗方法有重要的实际意义。

技术领域

本发明属于小鼠模型领域，具体涉及一种半乳糖基转移酶GalT基因点突变小鼠模型的构建方法及其用途。

技术背景

先天性糖基化疾病(CDG)最初被称为碳水化合物缺乏糖蛋白综合症(CDGS)，是一种N-糖基化异常的疾病，临床特征涉及许多器官系统，尤其是大脑某些区域的发育以及胃肠、肝、视觉和免疫系统的功能，几乎所有患者的血清糖蛋白唾液酸化不足。目前关于糖基化疾病的研究多集中于临床病例，但由于病例分型多，样本少导致无法进行广泛系统性研究。定点突变小鼠可批量繁殖，有利于多样本研究。

半乳糖基转移酶不仅在细胞运动、胚胎发育、神经系统发育、免疫系统及炎症反应中有重要作用，还在糖蛋白N-糖基化的唾液酸化进程中起到不可或缺的作用。突变半乳糖基转移酶可作为研制先天性糖基化疾病模型小鼠的理论基础。

发明内容

基于现有技术的状况，本发明目的是提供一种半乳糖基转移酶GalT基因点突变小鼠模型的构建方法及其用途。利用同源重组、随机插入、RNAi等技术，应用敲除、定点突变、基因失活等策略对半乳糖基转移酶基因进行改造使其失活。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

一种半乳糖基转移酶GalT基因点突变小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：针对小鼠B4GalT基因，设计基因敲除策略，敲除区突变域选择；采用基因编辑方法，获得F0代小鼠，将阳性F0代小鼠和C57BL/6J配繁后，得到具有B4GalT基因定点突变的阳性F1代杂合子，阳性杂合子小鼠交配后经PCR测序确认获得阳性纯合子。

进一步的，一种半乳糖基转移酶GalT基因点突变小鼠模型的构建方法，包括如下具体步骤：

(1)靶点构建：寻找半乳糖基转移酶B4GalT基因的CDS区，明确外显子部分，确定基因突变位点；

(2)获取受精卵，并进行显微注射：通过体外转录的方式，获得cas9 mRNA和gRNA，通过合成获得oligo donor DNA，将cas9 mRNA、gRNA和oligo donor DNA显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠；

(3)将阳性F0代小鼠和C57BL/6J配繁后，得到具有B4GalT基因定点突变的阳性F1代杂合子；

(4)阳性杂合子小鼠交配后经PCR测序确认获得阳性纯合子，表明小鼠模型构建成功。

进一步的，为小鼠第4染色体的第4外显子B4GalT1基因中的286位氨基酸。

更进一步的，所述突变位点是将第286位氨基酸酪氨酸突变为亮氨酸。

进一步的，所述gRNA的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步的，所述oligo donor DNA的序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步的，所述F0代小鼠的鉴定引物如SEQ ID NO:3所示。