[发明专利]一种高亲和力增强绿色荧光蛋白纳米抗体及其编码基因的筛选方法

说明书

本发明属于基因工程领域，具体为公开了高亲和力增强绿色荧光蛋白纳米抗体及其编码基因的筛选方法。所述抗体是含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。还公开了一种宿主细胞，可以表达抗EGFP纳米抗体，具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性以及高表达性。本发明提供的抗EGFP纳米抗体可特异性的结合绿色荧光蛋白，且其有较高亲和力，可应用与EGFP的基础研究中。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种高亲和力增强绿色荧光蛋白纳米抗体及其编码基因的筛选方法。

背景技术

绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein GFP)是Shimomure等于1962年首次从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)中分离出的蛋白，可自发产生荧光，发色基团位于β桶和α-螺旋形成的致密结构域中，其性质稳定，被广泛应用于抗体检测、细胞内定位、单分子荧光成像等。EGFP(enhanced green fluorescent protein),即增强绿色荧光蛋白,是经过改造后的定点突变体增强型GFP，其荧光强度更强，更易于检测，常作为在报告基因来研究基因表达调控，探索信号通路以及示踪成像等，EGFP作为生命科学研究中最常用的工具蛋白，具有很高的研究与应用价值。使得针对EGFP的高亲和力特异性抗体在基础生物研究十分重要。

纳米抗体是一种天然缺失轻链的功能性抗体(即重链抗体)，能与特异性的抗原结合。这种抗体的可变区域仅仅由一条链组成，因此又称为单域重链抗体，体积很小，分子大小仅为15kDa。具有免疫原性低、稳定性高、可溶性好；可以使用多种不同的表达系统如细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞甚至植物宿主细胞等进行表达。这些优良的特性使得纳米抗体在基础研究领域具有极大的应用价值。

EGFP单克隆或多克隆抗体是通过免疫动物获得的，但其相对分子质量较大、生产成本高、稳定性差等问题，其应用受到限制。由于纳米抗体能在微生物中稳定高效表达，可以克服这些问题，因此开发高亲和力的抗EGFP纳米抗体及其原核表达载体和菌株，在对以EGFP为标签的蛋白研究中将有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供针对EGFP的高亲和力纳米抗体，以及该纳米抗体的原核表达载体和菌株。本发明表达纯化了该纳米抗体并证明了纳米抗体亲和力高且能够特异结合EGFP，可应用于EGFP基础研究。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供了一种高亲和力增强绿色荧光蛋白纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中所述纳米抗体的可变区序列由SEQID NO.1所述氨基酸序列组成，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种高亲和力增强绿色荧光蛋白纳米抗体的编码基因的筛选方法，包括以下步骤：

(1)用绿色荧光蛋白免疫羊驼，第4次免疫后抽取羊驼外周血，分离血细胞提取血细胞总RNA，反转录成cDNA后，通过PCR扩增得到VHH编码基因；

(2)将VHH编码基因克隆到噬菌体展示载体上，构建VHH噬菌体展示文库；

(3)将绿色荧光蛋白包被于酶标板中，通过噬菌体展示技术从文库中富集绿色荧光蛋白纳米抗体；

(4)通过ELISA方法筛选阳性单克隆；

(5)阳性单克隆菌落送测序，获得绿色荧光蛋白纳米抗体基因序列。

进一步地，所述载体为pComb3XSS。

本发明还提供一种宿主细胞，包括所述蛋白质或表达载体，细胞可选择大肠杆菌BL21(DE3)，易于培养，周期短，操作方便，且菌株能够稳定扩增。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：