[发明专利]一种检测小分子半抗原的均相免疫方法

权利要求书

1.一种检测小分子半抗原的均相免疫方法，其特征在于，以特异性噬菌体为竞争抗原及相应抗体标记的多枝状胶体金为动态光散射信号增强探针，以溶液的平均水化动力学粒径变化作为动态光散射信号输出，利用水化动力学直径变化测定反应待检样品中小分子半抗原的含量，包括以下步骤：

（1）以表面修饰羧基链的多枝状胶体金为载体采用EDC一步法将小分子特异性单克隆抗体标记于多枝状胶体金表面，获得抗体标记的多枝状胶体金；

（2）通过噬菌体随机七肽库淘选出针对小分子抗体特异性的噬菌体，获得噬菌体竞争抗原；

（3）在抗体标记的多枝状胶体金溶液中加入噬菌体竞争抗原和待测溶液，37℃反应15-200min后于马尔文纳米粒度仪上测定溶液的平均水化动力学直径，利用水化动力学直径变化测定反应待检样品中小分子半抗原的含量；

其中，步骤（1）中所述抗体标记的多枝状胶体金的制备方法为：利用胶体金种子介导生长法合成多枝状胶体金溶液，将合成的胶体金溶液离心后，以pH 9.0-11.0 的超纯水置换，加入巯基-羧基双亲链，室温旋转搅拌4~12h；混合溶液离心，去除多余链，获得表面巯基羧基双亲链的多枝状胶体金；将表面巯基羧基双亲链的多枝状胶体金加入到pH 7.5 PB缓冲液中，加入小分子抗体，室温下搅拌反应，加入EDC后，搅拌补加两次，加入质量体积分数为10%的牛血清白蛋白，并加入EDC，室温搅拌30分钟后，离心将偶联了抗体的多枝状胶体金分离下来，获得抗体标记的多枝状胶体金。

2.根据权利要求1所述的一种检测小分子半抗原的均相免疫方法，其特征在于，步骤（2）通过随机七肽库淘选相应小分子抗体特异性的噬菌体，包括以下操作：以驴抗鼠抗体0.1 mL4℃包被两孔微孔板，洗板后，封闭向第一孔中加入噬菌体随机七肽库，第二孔中加入小分子半抗原相应的抗体，结合后，取第一孔中的上清液加入到第二孔中，孵育后，酸洗脱，取出洗脱液并用中和液中和至溶液pH值为中性；接着对得到的洗脱液进行扩增，即可得到大量高浓度特异性的噬菌体；加入25%的甘油，于-20℃冰箱中保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种检测小分子半抗原的均相免疫方法，其特征在于，取步骤（1）中获得的抗体标记的多枝状胶体金，用PBS梯度稀释后，测定溶液的平均水化动力学直径，取溶液平均水化动力学直径稳定的最低浓度为胶体金探针的使用浓度；在此胶体金探针的使用浓度下，测定不产生动态光散射信号的噬菌体竞争抗原的用量。

4.根据权利要求3所述的一种检测小分子半抗原的均相免疫方法，其特征在于，通过棋盘滴定法确定抗体标记的多枝状胶体金中抗体的标记量、以及步骤（3）中噬菌体竞争抗原的用量。