[发明专利]野生型气肿疽梭菌细胞毒素A及其制备方法、应用和疫苗

权利要求书

1.一种野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的制备方法，其特征在于，包括在革兰氏阳性菌表达系统中表达编码所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的基因，得到所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，编码所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

优选地，所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将编码所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的基因导入pYL质粒中，提取阳性克隆质粒经RN4220转化后，将构建的质粒电击转化进入革兰氏阳性菌表达系统中，得到表达所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的重组微生物，通过对重组微生物的诱导表达得到所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，得到表达所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的重组微生物后，还包括对所述重组微生物进行培养的步骤，然后通过对重组微生物的诱导表达得到所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。

5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述革兰氏阳性菌表达系统包括如下(a)-(d)中的任一种:

(a)表皮葡萄球菌表达系统；

(b)枯草芽孢杆菌表达系统；

(c)谷氨酸棒状杆菌表达系统；

(d)乳酸杆菌表达系统。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述革兰氏阳性菌表达系统为表皮葡萄球菌表达系统；

优选地，所述重组微生物为重组表皮葡萄球菌株SE/pYL-CctA；

优选地，所述诱导表达的条件包括使用终浓度为300～700ng/mL的诱导剂ATC在35℃～40℃诱导16～36小时；

优选地，所述诱导表达的条件包括使用终浓度为500ng/mL的诱导剂ATC在37℃诱导24小时；

优选地，种子液接种量为0.1～5％(v/v)，优选为1％(v/v)；

优选地，补料碳源包括葡萄糖和/或甘油，优选为甘油。

7.应用权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。

8.生物材料，其特征在于，所述生物材料的活性成分包括权利要求7所述的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。

9.如权利要求1-6任一项所述的制备方法或权利要求7所述的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A或权利要求8所述的生物材料在制备如下(A)-(C)中任一项的应用：

(A)气肿疽梭菌疫苗；

(B)气肿疽梭菌诊断抗原；

(C)气肿疽梭菌单克隆抗体。

10.一种气肿疽梭菌疫苗，其特征在于，所述气肿疽梭菌疫苗包括权利要求根据权利要求7所述的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A或权利要求8所述的生物材料；

优选地，所述气肿疽梭菌疫苗包括权利要求7所述的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A和辅料；

优选地，所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的浓度为30～70μg/mL，优选为50μg/mL；

优选地，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种；

优选地，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、MF59佐剂或Montanide ISA系列佐剂；优选使用Montanide ISA系列佐剂；更优选使用ISA35A佐剂。