[发明专利]一种人工合成的抗虫蛋白mCry1Ia2及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种人工合成的抗虫蛋白mCry1Ia2。本发明还公开了所述蛋白的核酸分子，以及所述核酸分子的重组载体、宿主细胞或重组菌。还公开了所述蛋白以及所述核酸分子及其重组载体、宿主细胞或重组菌等在调控植物抗虫性、杀虫或提高转基因植物抗虫性和制备杀虫剂或防虫害制剂中的应用。体外实验证明改造合成的Bt基因产毒蛋白对玉米螟更高的杀虫活性，且对Cry1Ab、Cry1F、Cry1Ie毒蛋白抗性玉米螟种群有显著的杀虫效果。本发明利用组成型启动子构建了新的植物表达载体，抗虫基因mCry1Ia2能够在单子叶植物中稳定高效表达，进而用于生产抗虫转基因植物。

技术领域

本发明涉及基因工程和生物防治领域，具体地说，涉及一种人工合成的抗虫蛋白mCry1Ia2及其制备方法和应用。

背景技术

Bt基因编码杀虫晶体蛋白，来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，其广泛存在于水、土壤、沙漠、树叶、昆虫尸体中，是现今产量最大、使用最广的生物杀虫剂。它在形成孢子时可以形成杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)，又称δ-内毒素，可以对鳞翅目和鞘翅目等农业害虫产生特异性的杀虫活性。其作用过程包括昆虫体吞食原毒素、原毒素酶解与活化、毒素穿过围食膜、毒素与特定受体结合、毒素分子嵌入表皮细胞膜、形成离子通道、中肠细胞的离子失衡后细胞裂解。在过去的几十年里，已确定数十种苏云金芽孢杆菌菌系及130多种它们编码的杀虫晶体蛋白。

Whiteley和Schnepf于1985年发表了从苏云金芽孢杆菌中克隆得到的cry基因核苷酸序列。随着不断发现新的Bt菌株以及Bt基因的克隆，Bt家族的成员不断增多，根据数据库(www.lifesci.sussex.ac.uk)最新更新数据统计，目前在分离得到的Bt菌株中已经识别并且命名了975个杀虫蛋白基因，包括789个Cry基因，38个Cyt基因以及142个Vip基因。通过将Bt基因导入植物中来培育抗虫转基因作物，是Bt基因的主要应用方向。根据国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)网站的数据统计发现，通过安全评价Bt基因的转化事件共有345个，其中玉米转化体事件通过审批的有255个。

孟山都和迪卡公司于1990年获得了结实正常的转Bt基因玉米。1993年，Koziel等研发出转cry1Ab基因玉米，Michael等通过改造cry1Ab基因获得的转基因玉米株系对玉米螟具有较高抗性。1996年，美国开始商业化种植转基因抗虫玉米。1997年，美国正式批准了4个转Bt基因玉米品种可进行销售，包括由孟山都公司推出mon810，Syngenta公司推出的bt176、bt11，以及迪卡公司的DBT418，其防治对象均为玉米螟，该年抗虫转基因玉米的种植面积达到320万hm²。地老虎、玉米根叶甲等地下害虫同样影响玉米产量，因此孟山都公司推广防治地下害虫“mon863”(cry3Bb)，并获得了可以同时对玉米螟和地下害虫有防治效果的抗虫玉米“mon863×mon810”。2007和2008年，先正达公司推出了防治鳞翅目害虫和地下害虫的mir604(cry3A)和mir162(Vip3Aa)。又分别在2011年和2012年推出了双基因的“bt11×GA21×mir162”和三基因的“bt11×mir162×mir604×GA21”抗虫玉米。