[发明专利]基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的亚洲型舞毒蛾检测方法及其引物和探针

权利要求书

1. 基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的检测用引物探针组合，其特征在于所述引物包括上游引物LDND2-F和下游引物LDND2-R，所述LDND2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述LDND2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为LDP，所述LDP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，该探针的5’端以FAM报告荧光基团标记，3’端以MGB淬灭基团标记。

2.如权利要求1所述的引物探针组合在采用Taqman-MGB实时荧光PCR技术检测舞毒蛾中的应用，所述检测用于区分亚洲型舞毒蛾与毒蛾属其它昆虫。

3.基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的舞毒蛾检测方法，其特征在于，所述检测方法用于区分亚洲型舞毒蛾与毒蛾属其它昆虫；包括以下步骤：

（1）对不同地理种群的舞毒娥成虫的足进行DNA提取，对其中mtDNA部分基因的序列进行测序分析，选择突变率高的序列片段作为扩增的目的片段；

（2）设计特异性引物和探针，上游引物为LDND2-F，下游引物为LDND2-R，LDND2-F/LDND2-R的扩增产物长度为71bp，特异性探针为LDP，所述LDND2-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述LDND2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述LDP的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，该探针的5’端以FAM报告荧光基团标记，3’端以MGB淬灭基团标记；

（3）进行实时荧光PCR扩增检测；

（4）建立标准曲线，以步骤（1）得到的DNA为标准品，进行10倍递减梯度稀释成5个浓度，每一浓度取2μL作为模板进行实时荧光定量PCR检测，以不同浓度的靶标DNA片段拷贝数的对数值作为横坐标，DNA相应的临界循环次数C_t值作为纵坐标，绘制标准曲线以进行相关性分析，用于舞毒蛾的定量快速检测分析。

4. 如权利要求3所述的基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的舞毒蛾检测方法，其特征在于所述步骤（3）和（4）中PCR扩增体系为20μL：2×TaqMan probe Real-time PCR MasterMixture 6μL，10μM上下游引物分别0.5μL，DNA模板2μL，10PM 的探针LDP0.8μL，加ddH₂O至20μL。

5. 如权利要求3所述的基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的舞毒蛾检测方法，其特征在于所述步骤（3）和（4）中PCR扩增反应程序为：预变性95℃10min；然后95℃ 30sec，63℃30sec循环40次。

6.如权利要求3所述的基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的舞毒蛾检测方法，其特征在于所述步骤（4）中标准曲线关系式为Y=-2.85x+36.705，R²=0.9965。