[发明专利]一种蛋白核小球藻叶绿体转基因系统及其应用

说明书

本发明公开了一种蛋白核小球藻叶绿体转基因系统及其应用，所述蛋白核小球藻叶绿体转基因系统包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中不小于1000bp的连续片段作为上游同源臂和下游同源臂，及插入上游同源臂和下游同源臂之间的启动子、终止子和外源基因。本发明利用来源于蛋白核小球藻非光依赖性叶绿素酸酯氧化还原酶DPOR的基因(chlL)的序列片段作为上下游同源重组片段，成功构建了蛋白核小球藻的叶绿体转基因系统，转化载体可以将外源基因导入蛋白核小球藻叶绿体，并使之在蛋白核小球藻叶绿体中高效稳定的表达。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种蛋白核小球藻叶绿体转基因系统及其应用。

背景技术

蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)属于绿藻门(Chlorophyta)绿藻纲(Chlorophyceae)绿球藻目(Chlorococcales)卵囊藻科(Oocystaceae)小球藻属(Chlorella)，蛋白核小球藻在学术分类上也称为Auxenochlorella pyrenoidosa。蛋白核小球藻细胞呈球形或椭圆形，细胞壁较坚固，含有1个呈杯状叶绿体。自养生长下的叶绿体内常有1个色素体，1个淀粉核，细胞直径约5μm。蛋白核小球藻既可以自养生长，也可以异养生长。

蛋白核小球藻的蛋白质含量可高达55％～65％，可作为优良植物蛋白源。在特定的培养条件下，蛋白核小球藻总脂含量可以达到细胞干重的38％以上，不饱和脂肪酸含量可高达总脂肪酸的75％，其中亚油酸含量约47％，亚麻酸含量约10％，油脂产率可达126.3mg/(L·d)以上。蛋白核小球藻还富含芦丁、类胡萝卜素等营养素，是优良的食品资源。蛋白核小球藻已经被我国原卫生部批准为食品新资源。由于蛋白核小球藻具有良好的食品安全性，是少有几种可作为食品材料的微藻之一，可以用其加工食品或饲料。利用蛋白核小球藻作为转基因宿主开发基因工程食品和饲料或者其他生物活性物质，宿主安全性具有保证。因此，利用蛋白核小球藻开发转基因食品、药品、疫苗等相比于其他微藻具有优势。

蛋白核小球藻与其他光合作用真核细胞一样具有细胞核、叶绿体和线粒体三套DNA分子，构成既独立又相互联系的遗传体系。在细胞内的三套遗传体系中，核基因组遗传体系具有一些明显的困难：(1)细胞核基因组庞大，结构复杂；(2)在基因转化过程中外源基因被随机插入到基因组的不确定位置中，常常无法表达而成为沉默基因；(3)外源基因表达效率低，且表达不稳定；(4)外源基因的插入有时会改变其他重要性状而降低宿主的生命力或者降低经济价值；(5)外源基因容易扩散，可能有对环境的基因污染的风险等。

叶绿体是微藻光合作用的场所，其遗传物质为双链环状DNA。通常一个叶绿体中有多个基因组拷贝。叶绿体基因组大小在120～160kb，GC含量在25％～38％。叶绿体基因组具有原核生物基因的特点，与功能相关的基因多为多顺反子转录单位其排列顺序具有高度保守性。1988年在莱茵衣藻上首次开展了叶绿体遗传转化，此后，叶绿体转基因研究在其他微藻和烟草等植物中开展。与核转化相比，叶绿体转化技术具有如下特点：(1)外源基因通过同源片段精确定点插入到叶绿体基因组中，可以较好解决基因失活、基因沉默、位置效应等问题；(2)由于叶绿体中常常有多个基因组拷贝，当同质化后，外源基因的拷贝数高，表达效率高、基因丢失的风险小；(3)叶绿体基因组属于原核表达系统，可以以多顺反子的形式将多个基因转入叶绿体，有利于标记基因和目的基因等进行共同转化；(4)对于高等植物来说，叶绿体为母系遗传，能较好避免转基因植物对周围环境造成生物安全危害。

影响叶绿体转化系统效果的两个关键因素有：(1)合适的叶绿体转化载体；(2)有效的载体导入方法。叶绿体转化载体中表达盒的设计是重要因素，其中要素包括同源片段、标记基因和适合叶绿体的启动子、终止子。