[发明专利]一种突变的高丝氨酸激酶及其应用

说明书

本发明涉及氨基酸技术领域，具体公开了一种突变的高丝氨酸激酶及其应用。本发明所述突变的高丝氨酸激酶第195位氨基酸发生突变。本发明通过诱变筛选获得了苏氨酸产量较佳的菌株，通过验证获得了高丝氨酸激酶R195Q突变对于苏氨酸以及异亮氨酸的合成是有效位点的结论，其编码基因被转导的微生物中苏氨酸以及异亮氨酸产生能力得到显著改善，同时能够更好的解除苏氨酸的反馈抑制作用。

技术领域

本发明涉及氨基酸修饰技术领域，更具体的说是涉及一种突变的高丝氨酸激酶及其应用。

背景技术

L-苏氨酸和L-异亮氨酸，均是人体必需氨基酸。广泛应用于食品、饲料、化妆品与医药等行业。两者均是使用通过高丝氨酸激酶从高丝氨酸产生的高丝氨酸磷酸。因此，为了经由发酵方法产生氨基酸，必须将生物合成途径中使用的酶的活性保持在一定水平或更高水平，并且已经对其进行了深入研究。

L-苏氨酸合成途径中有3个关键酶受到反馈抑制作用，分别是天冬氨酸激酶(AK)，高丝氨酸脱氢酶(HD)，高丝氨酸激酶(HK)。异亮氨酸是苏氨酸的下游产物，所以对于异亮氨酸的合成路径来说，除上述3种酶之外，还有苏氨酸脱氢酶(TD)和乙酰羟丁酸合成酶(AHAS)。其中高丝氨酸激酶，编码基因为thrB，以竞争性抑制机制被L-苏氨酸抑制。这使得解除苏氨酸对高丝氨酸激酶的反馈抑制变得困难。最近，已有关于thrB对L-苏氨酸的反馈抑制的脱敏的报道。在2018年，Choong-Min Kang发表了一篇在thrB基因中引入突变位点A20G解除苏氨酸对thrB基因的反馈抑制。尽管如此但仍需要继续研究以发现更好的突变体。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种突变的高丝氨酸激酶，使得所述高丝氨酸激酶能够显著提高苏氨酸产量；

本发明的另外一个目的在于提供一种突变的高丝氨酸激酶，使得所述高丝氨酸激酶能够显著提高异亮氨酸产量；

本发明的另外一个目的在于提供一种突变的高丝氨酸激酶，使得所述高丝氨酸激酶能够同时显著提高苏氨酸和异亮氨酸产量；；

本发明的另外一个目的在于提供一种突变的高丝氨酸激酶，使得所述高丝氨酸激酶在解除苏氨酸的反馈抑制作用上具备更佳的效果；

本发明的另外一个目的在于提供上述高丝氨酸激酶在生产苏氨酸和/异亮氨酸中应用，以及在构建生产苏氨酸和/异亮氨酸工程菌中的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种突变的高丝氨酸激酶，第195位氨基酸发生突变。

本发明通过对野生型棒杆菌属的菌株进行化学诱变筛选抗AHV菌株，所获得的87株突变菌株中有11株表现出优异的L-苏氨酸的生产能力。将上述11种菌株命名为SMI001至SMI011，而其中属SMI001的苏氨酸的产量最高，副产物最少，是苏氨酸的最佳生产菌。

鉴于SMI001在苏氨酸生产中的优异表现，本发明通过基因技术验证了其thrB的核苷酸序列中，鸟嘌呤(其是本发明SEQ ID NO:2所示序列的第584位核苷酸)突变为腺嘌呤，因此编码精氨酸残基的CGA密码子突变为编码谷氨酰胺残基的CAA密码子(即高丝氨酸激酶发生R195Q突变)。为此，本发明通过基因工程手段构建R195Q突变相关工程菌，验证了高丝氨酸激酶R195Q突变对于苏氨酸以及异亮氨酸的合成是有效位点，故在本发明具体实施方式中，所述突变的高丝氨酸激酶第195位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酰胺，其蛋白序列如SEQ ID NO:3所示。

同时，本发明还提供了所述突变的高丝氨酸激酶的编码基因，其可以是任何能够编码表达R195Q突变高丝氨酸激酶的序列，在本发明具体实施方式中，所述编码基因的序列如SEQ ID NO:2所示。