[发明专利]缺失E66L、I267L基因的非洲猪瘟减毒及活疫苗

说明书

本发明公开了一种缺失E66L、I267L基因的非洲猪瘟减毒及活疫苗公开了一类新的减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒；通过对E66L、I267L部分或全部基因功能进行缺失，所得的重组毒株与亲本毒株相比，在感染猪后，发热和病毒血症未出现或显著减轻，试验猪均健活；该类基因缺失活病毒制备的疫苗可保护易感猪免受ASFV强毒感染或人为攻毒，可用于非洲猪瘟的预防。

发明领域

本发明涉及一种非洲猪瘟基因缺失减毒，尤其是公开了一种缺失E66L、I267L基因部分或全部功能的非洲猪瘟减毒，本发明还进一步提供利用该减毒制备的非洲猪瘟基因缺失活疫苗，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

非洲猪瘟（ASF）是非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的高度接触传染性致死性疾病，死亡率接近100％，给养猪业带来重大损失。针对非洲猪瘟的防控，过去主要采取扑杀和清除的方法，迄今为止，尚无研制成功疫苗。非洲猪瘟病毒基因组全长170-190kb,编码150~180个ORFs,至今已发现包括多基因家族基因等在内的大量与病毒毒力、免疫抑制、抑制凋亡等相关的基因，如毒力因子如9GL、UK等(Lewis et al., 2000) (Zsak et al., 1998)，免疫抑制因子如MGF360、MGF505等(Afonso et al., 2004)、血吸附因子如CD2v等(Rodriguez et al., 1993)。

近年来针对ASFV MGF360、MGF505、CD2v等基因进行缺失的减毒疫苗株，以及在自然界中分离的自然弱毒株，在猪体内证实有一定的免疫效果，但在田间试验中发现，这些自然弱毒和人工缺失株疫苗使用后可产生慢性病变，如皮肤溃疡、发热、关节肿胀等不良反应（King et al.，2011；Leitao et al.，2001；Revilla et al.，1992）。因此，阐明更多未知基因功能，进而探索利用其作为更为安全有效的新疫苗，一直是非洲猪瘟防控的重要课题。

发明内容：

本发明提供了一种减毒的非洲猪瘟病毒，即缺失了E66L、I267L部分或全部功能的非洲猪瘟活病毒；在此基础上再缺失其他致病基因片段或全基因可进一步提高其安全性。该类基因缺失活病毒可保护易感猪免受ASFV强毒感染或人为攻毒，可用于非洲猪瘟的预防。

本发明公开的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒，基因序列如：SEQ No.1所示，缺失以下基因的功能：基因组右端E66L、I267L。

其中，基因组右端的E66L、I267L 1-2个基因的缺失；基因组右端的E66L、I267L每个基因部分缺失或完全缺失。

基因组右端E66L基因序列如：SEQ No.2所示；

基因组右端I267L基因序列如：SEQ No.3所示；

本发明所示的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒，其特征在于：构建的与E66L、I267L联合缺失ASFV其他致病基因如CD2v、MGF360、MGF505、A238L、A224L、EP153R、A276R、DP96R、DP71L、B119L等的重组缺失病毒。

本发明所示的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒，其特征在于：其涉及的基因组包括所有非洲猪瘟病毒（不同基因型）的毒力分离株。

本发明所述的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1）E66L、I267L 1个或2个基因缺失病毒的构建

以pUC-EGFP质粒为载体，以E66L、I267L中1个或2个基因为目标（X），分别构建含目的基因（X）左右同源臂的重组质粒，与亲本毒株共转染BMDM细胞，筛选并纯化得到缺失目的基因的重组病毒△X；

2）E66L、I267L中1个或2个基因与ASFV其他基因联合缺失毒株的构建