[发明专利]纳米孔测序平台的宏基因组建库方法及其试剂盒

说明书

本发明涉及一种纳米孔测序平台的宏基因组建库方法及其试剂盒。通过对建库中的末修连接以及PCR扩增等进行优化调整，本发明的建库方法及其试剂盒有效降低了建库起始量，提高了测序数据读长和质量，压缩了建库和测序时间，节约了测序成本，同时还提高整个流程的灵敏度，满足了临床对于感染检测的要求，适于推广应用。

技术领域

本发明涉及测序领域，具体涉及一种基于纳米孔测序平台的宏基因组建库方法及其试剂盒。

技术背景

感染性疾病是造成人类疾病和死亡的重要原因。在呼吸道感染中，2016年，全球下呼吸道感染造成至少300万人死亡。然而，由于方法的局限性，确定下呼吸道感染的病因仍然具有挑战性。诊断下呼吸道感染的传统方法包括培养和血清学检查，敏感性低并且耗时长。从统计学上讲，只有38％的具有影像学证据支持的成年肺炎患者可以成功鉴定到病原体。广谱抗生素的滥用使病原体的鉴定更加困难。对于每位患者，缓慢的诊断过程会导致经验性的广谱抗生素治疗不当，随后肠道微生物组紊乱，治疗效果差，住院时间延长和费用负担增加。更不用说这种经验性的广谱抗生素治疗会加剧全球耐多药病原体。

与培养方法不同，分子方法通过丰富的遗传分子识别病原体，从而跳过了微生物生长的大量时间，因此比培养方法要快得多。靶向方法(如PCR)是快速的诊断方法，但是只能对于特定的病原体进行检测，对于罕见或新发病原体难以及时鉴定。因此，快速、准确地确定下呼吸道感染病原体对于临床具有重大意义。

宏基因组测序鉴定相较于传统的培养鉴定方法，鉴定周期短、对操作人员技术水平要求低等优势。宏基因组测序也克服了很多不能培养的微生物的鉴定弊端，越来越多地应用于微生物鉴定中，特别是不明原因病原微生物的鉴定。目前主流的宏基因组测序方法主要是高通量测序方法，包括二代测序和三代测序。其中三代测序如纳米孔测序以其包括超长序列读长、实时数据产生生信分析和设备小巧便携等卓越的特征，是目前比较快捷方便的宏基因组研究方法。

在宏基因组的研究领域，对于一些珍贵的样本，往往提取获得的核酸量非常有限；另一方面如果在样本处理过程中使用了去宿主流程，这样提取得到的核酸量也非常低，因此，在很多情况下，为了满足测序上机的要求，通过PCR扩增来提高样本总量，还是一个必不可少的选择。

目前英国牛津纳米孔公司提供的官方试剂盒中满足低起始量、提供多样本混合测序功能的试剂盒只有快速PCR条码试剂盒(SQK-RPB004)和PCR条码试剂盒(SQK-PBK004)。但是PCR条码试剂盒(SQK-RPB004)是通过转座酶打断的方法来添加Barcode，这往往需要基因组比较完整，而对于临床样本而言提取后基因组常常片段化严重，因此影响建库成功率。而PCR条码试剂盒(SQK-PBK004)的建库起始量要求100ng，首先通过NEBNext末端修复/dA尾添加模块(NEBNext End Repair/dA-tailing module)进行修复和dA尾添加，中间经过一步纯化，再将含有引物位点的接头连接至制备好的末端纯化产物上，试剂盒中含有12个引物对，进行PCR体系(LongAmpTaq 2X master mix，延伸时间6mins)来扩增每个样本。后面进行混库，纯化，加接头，上机测序。可以看到这个流程耗时很长，无法满足临床对于感染检测流程简便、快速的需求，

现有技术中仍亟需一种更为高效便捷，适宜于临床样本核酸低质量特点的宏基因组测序的建库方法。有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明需要解决的核心目的是寻求一种能够缩短时间和节约成本的测序建库试剂盒。本发明在对基于ONT PCR条码试剂盒(SQK-PBK004)建库进行优化时，惊奇的发现，当选择Vazyme的末端修复酶和连接酶，以及Takara的聚合酶替换原流程中的酶体系后，能够显著降低建库起始量，提高测序数据读长、质量以及整个流程的灵明度，还明显压缩建库和测序时间，节约了测序成本。

进一步的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种基于纳米孔测序的建库方法，所述方法包括如下步骤：