[发明专利]一种血管内皮祖细胞的分离培养方法

说明书

本发明提供血管内皮祖细胞的分离培养方法，包括分离和培养，分离步骤为：收集、稀释样品，叠加到Ficoll细胞分离液上；离心；加入阻断剂，混匀；加入磁珠耦联的CD133单克隆抗体,充分混匀，孵育；用PBS洗涤细胞，以去除未结合的抗体；用PBS缓冲液重悬细胞以备用；将分离柱置于磁场中，以分离缓冲液冲洗分离柱；将标记CD133单抗的细胞悬液缓慢贴壁加入分离柱，避免产生气泡，细胞悬液从分离柱下端自然流出；用分离缓冲液洗涤分离柱，洗掉不能结合到柱上的细胞；将分离柱移除磁场，加分离缓冲液加压洗脱吸附细胞，即得CD133阳性的血管内皮祖细胞。本发明分离培养得到的血管内皮祖细胞纯度高、活力强、增殖快。

技术领域

本发明属于细胞分离培养领域，具体涉及一种血管内皮祖细胞的分离培养方法。

背景技术

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）是一类具有分化为血管内皮细胞的前体细胞，不仅参与胚胎期血管发生，也参与出生后血管新生和血管内皮损伤后的修复过程。当血管内皮受损时，体循环中的EPCs在多种因子的作用下迁移到特定的位点进行分化增生，促进血管修复。EPCs的血管修复作用及定向迁移作用使其在心血管疾病治疗领域及基因靶向治疗领域显示出了广泛的应用前景，是生物医学领域研究的热点之一。

公开号为CN103484423A的中国放专利申请公开一种分离培养家禽内皮祖细胞的方法包括以下步骤：(1) 选取20日龄健康肉鸡，翅下静脉采集外周血；(2) 用L-DMEM培养基按体积比1:1稀释外周血后，再按体积比1:1缓慢滴加到鸡淋巴细胞分离液中，2000 rpm离心15min后弃上清液，收集得到单个核细胞；(3) 将收集到的单个核细胞用L-DMEM 培养基离心洗涤1-2次，收集细胞，用EGM-2培养基重悬细胞并计数；所述EGM-2培养基含有体积百分比为10%的胎牛血清、100 IU/mL双抗以及血管内皮生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子-1；(4) 分别将单个核细胞按5×107个/孔、1×107个/孔和1×106个/孔的量种植于用50μg/ml浓度的鼠尾胶原蛋白预先包被过的6孔细胞培养板中，置39℃、5% CO2培养箱中进行原代培养；每24h半量换液一次；5天后每24 h换液一次，7天后每48h换液一次直到传代。

但是，以上现有技术的内皮祖细胞分离培养方法，收集单个核细胞后，用L-DMEM培养基离心洗涤后收集细胞，就用L-DMEM培养基、计数和培养，这样的方法存在以下缺陷：分离培养的血管内皮祖细胞纯度不够、活力不够、增殖慢。

发明内容

为了克服以上现有技术的分离培养的内皮细胞祖细胞纯度不够、活力不够、增殖慢缺陷，本发明提供过一种血管内皮祖细胞的分离培养方法，分离培养的血管内皮祖细胞纯度高、活力高、增殖快。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种血管内皮祖细胞的分离培养方法，步骤如下：

（一）分离：步骤如下：

（1）收集、稀释样品，然后叠加到Ficoll细胞分离液上；

（2）离心，收集界面层的单个核细胞，经过洗涤、离心并重悬；

（3）加入阻断剂，混匀；

（4）加入磁珠耦联的CD133单克隆抗体,充分混匀，孵育；

（5）用PBS洗涤细胞，以去除未结合的抗体；用PBS缓冲液重悬细胞以备用；

（6）将分离柱置于磁场中，以分离缓冲液冲洗分离柱；

（7）将标记CD133单抗的细胞悬液缓慢贴壁加入分离柱，避免产生气泡，细胞悬液从分离柱下端自然流出；

（8）用分离缓冲液洗涤分离柱，洗掉不能结合到柱上的细胞；