[发明专利]一种快速的无菌检查方法

说明书

本发明提供一种快速的无菌检查方法，通过在药典传统无菌检查培养基胰酪大豆胨液体培养基和硫乙醇硫酸盐流体培养基中，分别添加指示剂2,3,5‑triphenyltetrazolium chloride(TTC)和/或Calcofluor White M2R(CWM)，在培养过程中连续检测光强的变化值判断菌的有无，从而在3‑5天内快速完成样品的无菌检查。所述无菌检查方法具有检查时间短、灵敏度高、操作简便、成本低，能更快速准确地定性分析微生物污染状况。

技术领域

本发明涉及涉及药品、食品、生物制品、医疗器械等无菌产品检查领域，具体而言，涉及一种快速的无菌检查方法。

背景技术

无菌检查是确保无菌产品使用安全的必检项目，也是决定无菌产品生产周期的重要环节之一。如在药品领域中，各国药典对注射剂无菌检查均有严格要求，并基本形成了国际一致的检查标准与操作规程，有效地提高了制剂无菌保证水平。

但是现行无菌检查方法具有一定的局限性。首先，无菌检查周期较长，制约企业生产效率的提高：各国药典均规定无菌检查的培养周期为14天，如果不能判定结果的需经转种培养7天，如果判断出现“假阳性”结果则需复试一次，延长了产品的出厂等待时间和生产周期。其次，现行药典中对无菌检查的结果判断为肉眼观察微生物大量生长所产生的培养基浑浊，受观察人员的操作经验影响较大，具有一定的主观性，自动化程度低。另外，单纯依靠培养基浑浊判定样品无菌状况仍存在以下风险：肉眼观察对与非微生物生长引起的培养基浑浊则不易排除，对于生长缓慢、在规定检查时间内不引起培养基浑浊的微生物污染更无从识别，由此可能产生假阳性和假阴性判断，影响结果的准确性和可靠性。

鉴于上述问题，建立一种能够快速识别无菌制剂微生物污染的方法，提高检查灵敏度、准确度、缩短检查时间、提高检查自动化程度，以补充或替代现有方法，已经成为国内外无菌制剂研究的关注焦点，并形成了超声波检测法(CN201710675623.2)、PCR扩增检测法(CN201210306849.2)、微量量热法(CN201010211629.2)等新方法。以上各种方法提高了微生物污染的检查能力，但是由于受微生物粒径大小、其他微粒干扰、操作复杂、仪器设备及试剂昂贵或方法缺乏普适性(仅针对某种微生物，检测面窄)等因素的制约影响其推广应用，因而需要根据微生物的生命、生长特征尝试建立新的，更方便、准确、快速的无菌检查方法。

2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)，中文名为氯化三苯基四氮唑，是脂溶性光敏感复合物，最初用于检测种子生存能力，后来用于染色检测哺乳动物组织的缺血梗塞。TTC是呼吸链中吡啶核苷结核酶系统的质子受体，TTC与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，正常脑组织和有活力种子胚细胞活细胞中的脱氢酶可以将TTC还原成不溶性的红色稳定的三苯基臢(TTF)；而缺血组织细胞或胚种细胞内脱氢酶活性因死亡或生活力衰退下降，不能反应，故不会产生变化而呈现苍白色。因此可以根据染色部位和染色深浅程度来鉴定脑组织或者种子的活力。

Calcofluor White M2R(CWM)常用作真菌染色和细胞活力染色，可用作纤维素和锦纶织物、纸张和去污剂、肥皂的荧光增白剂，该染料可与几丁质结合，使荧光得以加强，可用来阐述骨架结构中几丁质的特殊位置，还可用来染色真菌细胞壁和染色白色念珠菌生物膜。

发明内容

为解决上述问题，本发明开发了一种更方便、准确、快速的无菌检查方法，所述方法通过在无菌检查培养基中添加指示剂2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)和/或Calcofluor White M2R(CWM)，然后通过培养和光学检测，能在3-5天内快速完成样品的无菌检查。

一方面，本发明提供了一种用于快速无菌检查培养基中的指示剂，所述指示剂包括2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)和/或Calcofluor White M2R(CWM)。