[发明专利]兽疫链球菌菌株及其应用

说明书

本发明提出了一种兽疫链球菌菌株。所述兽疫链球菌菌株的葡萄糖激酶基因过表达。根据本发明实施例的兽疫链球菌菌株经发酵处理后，所获得的HA产量显著提高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及兽疫链球菌菌株及其应用，更具体地，本发明涉及兽疫链球菌菌株以及发酵生产透明质酸的方法。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid或hyaluronan,HA)是由葡萄醛酸和氨基葡糖的双糖重复单位所组成的多糖，广泛分布于软骨组织、关节液和皮肤组织的真皮以及表皮中，并在其中起到保湿、营养、修复和预防损伤等生理作用。透明质酸的生产方法有动物组织提取法和发酵法，由于动物组织提取法的制备成本高，分离纯化复杂，逐渐被发酵法所取代。

由于发酵方法简单，所需原料易得，成本相对较低，微生物发酵法生产透明质酸是当前生产透明质酸最主要的方式之一。目前可用于直接生产HA的微生物菌株主要分为链球菌属中的A类和C类，如酿脓链球菌和兽疫链球菌等。兽疫链球菌作为C类链球菌中的一员，由于其更低的致病性，更高的HA产率而常常受到青睐。然而，利用微生物发酵法生产HA也体现出许多局限。受宿主菌的影响，不同宿主生产HA的能力不同，但摇瓶产量大多小于1g/L，发酵罐产量也一般在7g/L以内，这不但增加了生产成本，也难以满足日益增长的市场需求。以目前的宿主改良技术而言，化学诱变或物理诱变技术是筛选优良生产菌株的主流方式之一，但诱变育种周期较长、结果不确定性大、高毒性的弊端也常常是限制其发展的主要因素之一。

相比诱变育种而言，利用基因工程手段来定向改造宿主，从而获得高产菌株的手段具有更快捷、更可控、周期短的优势，是当前及未来最主要的育种技术之一。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

已知，合成HA的两个前体UDP-葡糖糖醛酸和UDP-N-乙酰葡萄糖胺都来自于6-磷酸葡萄糖。葡萄糖被运输进细胞体内后，经己糖激酶活化成6-磷酸葡萄糖(在兽疫链球菌中是葡萄糖激酶参与反应)，再进入糖酵解途径和HA合成途径。发明人通过构建葡萄糖激酶过表达载体，进而将过表达载体导入兽疫链球菌，在兽疫链球菌中增加原始前体6-磷酸葡萄糖的供应，最后兽疫链球菌HA的摇瓶产量可达到1.15-1.29g，较出发兽疫链球菌菌株0.8g的产量提高了将近40％-60％。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种兽疫链球菌菌株。根据本发明的实施例，所述兽疫链球菌菌株的葡萄糖激酶基因过表达。根据本发明实施例的兽疫链球菌菌株经发酵处理后，所获得的HA产量显著提高。需要说明的是，本申请所述的葡萄糖激酶基因是指可以表达葡萄糖激酶完整结构或功能区的基因，即所述葡萄糖激酶基因所表达出的葡萄糖激酶既可以是完整结构的葡萄糖激酶，也可以仅是葡萄糖激酶功能区，葡萄糖激酶基因的表达产物可催化促进葡萄糖活化成6-磷酸葡萄糖。

根据本发明的实施例，上述兽疫链球菌菌株还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述葡萄糖激酶基因过表达是通过增加葡萄糖激酶基因的拷贝数实现的。进而可显著提高葡萄糖激酶在兽疫链球菌菌株中的表达量。

根据本发明的实施例，所述葡萄糖激酶基因过表达是通过将所述葡萄糖激酶基因设置于强启动子的调控下实现的。进而可显著提高葡萄糖激酶在兽疫链球菌菌株中的表达量。

根据本发明的实施例，所述增加葡萄糖激酶基因的拷贝数是通过将携带所述葡萄糖激酶基因的游离载体或整合载体导入受体兽疫链球菌细胞内实现的。需要说明的是，本申请所述的游离载体是指载体进入宿主细胞后，不能使其携带基因整合入宿主基因组的载体，如本申请实施例2所述的pSET4-PGT；本申请所述的整合载体是指载体进入宿主细胞后，能使其携带基因整合入宿主基因组的载体，例如本申请实施例3所述的pSET4-APGTA。根据本发明的实施例，携带所述葡萄糖激酶基因的游离载体或整合载体导入受体兽疫链球菌细胞内之后，葡萄糖激酶基因可在兽疫链球菌细胞内表达，实现葡萄糖激酶的过表达。