[发明专利]一种调控葡萄种子发育的基因VvMADS39及其应用

说明书

提供一种调控葡萄种子发育的基因VvMADS39及其应用，所公开的基因完整开放阅读框序列全长741bp，编码247个氨基酸。构建了pCAMBIA2300‑35S‑VvMADS39过量表达载体和其在番茄中同源编辑载体CRISPR/Cas9‑SlMADS39，并通过叶盘转化法将其转入模式植物番茄Micro‑Tom。结果发现过量表达VvMADS39的转基因番茄果实和种子变小，其同源敲除植株番茄无法形成正常的果实和种子。研究发现VvMADS39基因是通过与VvMADS21相互作用共同调控种子的发育。所公开的发明是基因VvMADS39用于葡萄无核新品种开发的应用。

技术领域

本发明属植物生长发育基因的鉴定及基因工程技术领域，具体涉及一种调控葡萄种子发育的基因VvMADS39。

背景技术

MADS-box基因编码的蛋白是一类成员数目众多且广泛存在于真核生物体中的转录因子家族,该家族基因都含有一段50～60个氨基酸序列高度保守的“MADS盒子”,由于此保守结构最早在酵母MCM 1、拟南芥的AGAMOUS、金鱼草花器官特征基因DEFICIENS及人类血清应答因子SRF4中发现,因此以这四类家族成员的第一个字母将其命名为MADS-box基因。实验表明,该家族基因通过与其他转录因子相互作用形成同源或异源二聚体,在植株生长发育的诸多方面起重要调控作用：例如决定根的生长发育和顶端分生组织的分化、调控开花时间和花器官的发育、影响果实成熟和裂区的形成、影响胚珠及果实的发育。其实,MADS-box转录因子的功能已涉及到了植物生长发育的各个方面,决定着植物的产量、品质、抗性等多种农艺性状,其功能是通过与其他转录因子相互作用形成高度有序的同源或异源二聚体的方式实现的,其机理是相当复杂的,因此我们要加大力度研究其作用机理,要从整体水平上弄清MADS-box转录因子的上游和下游基因,形成一个综合的调控网络。

葡萄是世界性普遍栽种的经济果树之一，尤其在人们证实葡萄浆果中的白藜芦醇为各类水果之首及白藜芦醇在防治心血管疾病及预防癌症方面的重要医疗保健作用后，更加促进了市场对葡萄及相关产品的消费。国际市场上，无核葡萄已成为产业发展及育种研究的热点方向。目前存在的突出问题是无核品种单一，特别缺乏优质大粒、红色无核葡萄新品种。因此，挖掘葡萄无核基因并阐述其调控机理，对于通过转基因技术培育无核葡萄新品种、创建无核葡萄新种质，具有重要的理论和育种实践意义。

在高等双子叶植物中，最早对植物MADS-box基因功能的研究主要集中在花上,研究发现它调控了植株从营养生长到生殖生长的转换、对光周期的反应、开花时间、花器官的形成、花粉的发育及育性等等。从营养生长向生殖生长的转变一直到心皮和种子的发育，MADS-box基因家族参与了全部的过程。近年来，通过对矮牵牛和拟南芥研究发现了一些与胚珠发育相关的基因，并发现其中许多都属于MADS-box基因。除此之外，研究者指出葡萄种子形态发生调控基因VviAGL11上的Arg197Leu突变与无籽果实性状完全关联。由此可见，MADS-box转录因子在植物花，果实和种子发育过程中都发挥着重要调控作用，为本实验的开展提供了理论支撑。

关于葡萄无核基因、无核性状形成的分子机理，无核性状形成过程中差异表达基因数量、种类及其调控路径等重要科学问题仍不清楚。建立在新一代Illumina高通量测序平台基础上RNA-Seq技术已成为基因表达和转录组分析的重要手段。通过参考转录组结果以及种子发育相关的同源基因功能分析，对无核性状相关基因的发现具有重要意义。

本研究以课题组前期有核，无核葡萄杂交后代胚珠发育关键时期的转录组为依据，筛选出MADS-box家族基因。在此基础上，进行了VvMADS39在有核葡萄品种红地球和无核品种无核白中的组织器官及胚珠发育不同时期的定量表达。结果发现VvMADS39在无核品种中较有核品种高表达，这暗示着该基因参与植物的生长并且对葡萄无籽的形成贡献较大。原位杂交实验也说明该基因调控葡萄胚珠发育过程。遗传转化番茄获得稳定的过表达株系及基因编辑株系，旨进行基因功能研究及VvMADS39基因对果实和胚珠发育的调控机制，为转基因技术培育无核葡萄新品种提供理论依据。