[发明专利]一种快速检测慢病毒载体滴度的方法

说明书

本发明提供了一种快速检测慢病毒载体滴度的方法，具体地，本发明提供了一种测定慢病毒载体滴度的方法，包括：(a)提供一待测样品，所述待测样品含有慢病毒载体和游离的质粒DNA；(b)对所述待测样品分别进行RT‑PCR和PCR反应，从而获得待测样品中含有WPRE元件的拷贝数，所述含有WPRE元件的拷贝数包括含有WPRE元件的慢病毒载体中RNA的拷贝数以及含有WPRE元件的游离质粒DNA的拷贝数；(c)基于所述待测样品中含有WPRE元件的慢病毒载体中RNA的拷贝数，从而测定慢病毒载体滴度。本发明的方法可在2小时之内获得特异性定量结果，可用于快速定量评估慢病毒载体生产过程中各步骤中间产品的滴度，并且可以对终产品滴度实施控制。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体地，本发明涉及一种快速检测慢病毒载体滴 度的方法。

背景技术

基因治疗(gene therapy)是指将外源治疗性基因导入靶细胞，以纠正或 补偿因基因缺陷或异常引起的疾病，或通过外源基因表达的产物作用于疾病 靶点，以达到治疗目的。

外源基因可通过病毒载体或非病毒载体进行转导或递送，常用的非病毒 载体有脂质体、树枝状大分子、非天然阳离子聚合物、天然多糖等。非病毒 基因递送载体比较安全、稳定，但其转染效率通常较低。病毒载体是将外源 基因包装到天然病毒的外壳中，利用病毒对宿主细胞的感染性将外源基因导 入细胞中。常见的病毒载体包括逆转录病毒(recombinant retrovirus，rRV)， 重组慢病毒(recombinant lentivirus，rLV)、腺病毒(recombinant adenovirus， rAd)、腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)等。病毒载 体的转导效率比非病毒载体的转导效率要高很多，特别适合用于侵染难感染 的靶细胞，如淋巴细胞。

重组慢病载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基 因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具 有感染能力。重组慢病载体因其体内、外生物滴度高和免疫原性低等优势， 成为CART细胞和基因治疗的首选转基因载体。

目前重组慢病毒载体检测多使用p24Elisa方法和生物滴度定量法，前者 需要1天时间出结果，后者至少需要7天时间出结果，且有较高的非特异性。

因此，本领域迫切需要开发一种快速检测慢病毒载体滴度的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测慢病毒载体滴度的方法。

本发明的第一方面，提供了一种测定慢病毒载体滴度的方法，包括：

(a)提供一待测样品，所述待测样品含有慢病毒载体和游离的质粒DNA；

(b)对所述待测样品分别进行RT-PCR和PCR反应，从而获得待测样品中含 有WPRE元件的拷贝数，所述含有WPRE元件的拷贝数包括含有WPRE元件的 慢病毒载体中RNA的拷贝数以及含有WPRE元件的游离质粒DNA的拷贝数；

(c)基于所述待测样品中含有WPRE元件的慢病毒载体中RNA的拷贝数， 从而测定慢病毒载体滴度。

在另一优选例中，所述待测样品中含有WPRE元件的慢病毒载体中的RNA 的拷贝数用如下公式计算：含有WPRE元件的慢病毒载体中RNA的拷贝数和含 有WPRE元件的游离质粒DNA的总拷贝数－含有WPRE元件的游离质粒DNA的 拷贝数。

在另一优选例中，“基于所述待测样品中含有WPRE元件的慢病毒载体中 RNA的拷贝数”包括用公式Q1进行计算，从而获得慢病毒载体滴度：

Q1＝(待侧样品中重组慢病毒载体RNA的拷贝数*阳性品生物滴度)/阳性品 中重组慢病毒载体RNA的拷贝数；