[发明专利]一种小鼠骨髓树突状细胞诱导纯化方法

说明书

本发明公开一种小鼠骨髓树突状细胞诱导纯化方法，包括以下步骤：S1、小鼠骨髓细胞提取：用手术镊将股骨、胫骨保留端夹裂继续冲洗，最大限度获取细胞；S2、树突状细胞细胞培养：培养第三天保留原有培养基及细胞并加入新鲜培养基继续培养；S3、树突状细胞细胞纯化；采用Percoll分层液纯化诱导。本发明通过用手术镊夹裂骨骺端代替剪去骨骺端，将传统第三天离心后丢弃的细胞再次加回培养皿中，同时在第三日换液时加入新鲜培养基的基础上，保留原有培养基，极大地提高了收获的DC数；本发明通过Percoll液纯化筛选，得到DC细胞纯度达90％以上，且与经典磁珠分选的方式比较得率提高21％,且Percoll密度分选法消耗更低的成本。

技术领域

本发明涉及树细胞培养领域，具体的是一种小鼠骨髓树突状细胞诱导纯化方法。

背景技术

树突状细胞，也称DC细胞，是功能最强的抗原提呈细胞，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC能合成大量的MHCⅡ类分子；具有表达、摄取和转运抗原的特殊膜受体；能有效摄取和处理抗原然后迁移至T细胞区域，具有一个成熟化的过程；能激活初始型T细胞；少量的抗原和少量的DC即足以激活T细胞。由于它在机体的抗感染免疫，抗肿瘤免疫应答及移植免疫中的作用极其重要而备受重视，成为近年来免疫学研究的热点。DC在生物体内分布广泛，但数量较少，因此如何获得大量、纯化的DC就成为进一步研究DC特性及功能的前提。

目前，在研究DC细胞研究过程中，采用小鼠骨髓来源树突状细胞的诱导及纯化方式多种多样，但存在树突状细胞诱导周期长、数量少、纯化成本较高等不足，难以满足基础研究或临床研究的需求，为了改变上述缺点，采用延长诱导时间等，来增加细胞数量或提高纯度，但导致诱导周期延长，也延长了实验周期，增加了诱导成本。另外高纯度树突状细胞是进行其基础实验的前提，而目前经典的纯化技术均磁珠分选或流式分析为基础，仍然需要较高的成本，且操作复杂，不利于掌握。

发明内容

为解决上述背景技术中提到的不足，本发明的目的在于提供，。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种小鼠骨髓树突状细胞诱导纯化方法，包括以下步骤：

S1、小鼠骨髓细胞提取：处死小鼠后于无菌培养皿中取出小鼠下肢骨，剪去胫骨远端头和股骨近端头，保留完成胫骨近端头和股骨远端端头，取含有PBS注射器从保留骨骺端刺入进行冲洗骨髓细胞，再用手术镊将股骨、胫骨保留端夹裂继续冲洗，最大限度获取细胞，裂解获得的细胞中的红细胞后，流式检测并计算活细胞数量；

S2、树突状细胞细胞培养：将步骤S1中获得的细胞按比例加入培养基中，再放入恒温培养箱中培养，培养第三天保留原有培养基及细胞并加入新鲜培养基继续培养，培养第五天吸出部分培养基及悬浮细胞离心去上清液，PBS清洗数次后依次加入FCR抗体封闭、CD11c抗体孵育，然后在用PBS清洗数次后进行流式检测；

S3、树突状细胞细胞纯化：培养第六天收集细胞悬液离心洗涤去上清液，PBS清洗3次后加入预冷的PBS充分混匀重悬，然后将细胞混悬液采用Percoll分层液纯化诱导，将分选得到的细胞PBS重悬，取少量细胞悬液依次加入FCR抗体封闭、CD11c抗体孵育后进行流式检测DC细胞纯度，其余细胞悬液加入培养基中继续培养。

优选地，培养基成分包括40ng/mLGM-CSF、40ng/mLIL-4和10％RPMI-1640。

优选地，PBS为磷酸缓冲盐溶液。

优选地，步骤S1中选择4周龄小鼠。

优选地，步骤S1中加入2倍于细胞体积的红细胞裂解液，吹打混匀后静置1分钟，再加5倍于裂解液体积的冷PBS溶液终止裂解。

优选地，步骤S3中Percoll分层液的密度为1.055，采用Percoll分层液纯化诱导时取中间层细胞。

本发明的有益效果：