[发明专利]一种鲜马乳中乳脂肪球膜的提取及其蛋白质组学分析方法

说明书

本发明一种鲜马乳中乳脂肪球膜的提取及其蛋白质组学分析方法，所述提取方法先将罗氏蛋白酶抑制剂加入到鲜马乳中，离心后得到乳脂肪层，清洗后得到乳脂肪球膜蛋白溶液；再加入二硫苏糖醇孵育、碘乙酰胺室温避光孵育，加入尿酸缓冲液、碳酸氢铵溶液、含有胰蛋白酶的碳酸氢铵溶液酶解后得到酶解液，最后终止消化得到含有肽混合物的溶液，脱盐后冷冻干燥，得到肽混合物。蛋白质组学分析方法先采用液相色谱‑高分辨质谱技术获得m/z为300‑1700范围内的肽段，之后完成峰提取和峰对齐，对蛋白质种类和数量进行定性分析，LFQ响应强度统计学分析，筛选显著性表达蛋白质，完成聚类和差异可视化，对显著性表达蛋白质进行生物信息学分析。

技术领域

本发明涉及乳脂肪球膜分析技术领域，具体涉及一种鲜马乳中乳脂肪球膜的提取及其蛋白质组学分析方法。

背景技术

乳脂肪是鲜马乳和鲜牛乳的主要成分之一，乳脂肪以脂肪球的形式存在于鲜马乳体系中。乳脂肪表面由脂肪球膜包裹，脂肪球膜主要由以糖蛋白为主的特异性膜蛋白质和以神经鞘脂类为主的磷脂共同组成，这些组分具有重要的生物功能。乳脂肪球膜是厚度为10-50nm的3层结构，形成于乳腺上皮细胞的内质网，乳脂肪球膜最内层由甘油三酯吸附在疏水基上构成，乳脂肪球膜外层是被具有强亲水基结构的蛋白质覆盖，在强亲水基表面结合离子形成大量结合水。单层内膜是由极性脂质和蛋白质复合体形成，围绕的外膜是从分泌细胞的顶端质膜获得外层双层膜。

乳脂肪球膜中含有25％-60％的蛋白质，虽然在整个鲜马乳体系中占比很少，但却具有重要的生物功能特性，如抗黏附性、抗菌、抗癌等，并且与肠道相关疾病、自闭症和多发性硬化症等疾病相关，同时也参与信号传导和细胞调节、凋亡、分化、生长等生物过程。乳脂肪球膜中含量较高且具有显著生理活性功能的蛋白质有嗜乳脂蛋白、黄嘌呤脱氢酶/氧化酶、血小板糖蛋白4、脂肪酸结合蛋白、脂滴包被蛋白-2和黏蛋白-1等。

当前，乳脂肪球膜一般采用离心法从全乳中分离，对分离所得的上层固体用氯化钠缓冲液在特定温度下冲洗2～3次以减少膜成分的流失，随后在低温条件下破坏脂肪球膜，释放出脂肪球膜成分，再使用低pH值沉淀、高速离心或添加硫酸铵离心等方法收集脂肪球膜成分。在收集到乳脂肪球膜样品后，对它进行乳脂肪球膜蛋白质还原烷基化及酶解后获得乳脂肪球膜蛋白质，但是这种方式蛋白质提取得率较低，并且肽段生成量少，在之后数据库匹配过程中准确性较差。与此同时，蛋白质组学分析流程因其具有鉴别和量化数千种蛋白质的能力，已广泛应用在食品营养特性的深入研究中，但目前建立的鲜马乳中乳脂肪球膜的分析流程很少，而在小样本快速、可重复和高灵敏分析的情况下基于蛋白质组学分析乳脂肪球膜的方法还未见报道。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种鲜马乳中乳脂肪球膜的提取及其蛋白质组学分析方法，提高了蛋白质提取得率，提高了肽段的生成量，在使用数据库匹配过程中，保证了一定的准确性，实现鲜马乳的乳脂肪球膜蛋白质精准相对定量和功能富集注释，加深了人们对鲜马乳蛋白质的认识并对其深加工及副产品加工提供一定的方向。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种鲜马乳中乳脂肪球膜的提取方法，包括以下步骤：

步骤1，将罗氏蛋白酶抑制剂加入到鲜马乳中，罗氏蛋白酶抑制剂和鲜马乳的比例为42mg：50mL，将得到的混合体系离心后得到乳脂肪层，将乳脂肪层依次用磷酸盐缓冲液和十二烷基硫酸钠溶液清洗后，得到乳脂肪球膜蛋白的十二烷基硫酸钠溶液；

步骤2，按(1-2.4)μmol：(80-90)μL的比例，将二硫苏糖醇加入到乳脂肪球膜蛋白的十二烷基硫酸钠溶液中，得到的混合体系A在46℃-50℃下孵育后冷却至室温后，得到混合体系B；

步骤3，向混合体系B中加入碘乙酰胺至碘乙酰胺的最终浓度为60mM-70mM，之后将得到的混合体系C在室温下避光孵育后，得到混合体系D，再向混合体系D中加入尿酸缓冲液去除二硫苏糖醇和碘乙酰胺，得到混合体系E；