[发明专利]一种利用受体基因沉默技术构建和鉴定女性AD模型的方法

说明书

本发明公开了一种利用催产素受体基因沉默技术构建女性AD模型的方法及鉴定方法，通过构建并筛选得到AAV9‑Oxtr‑RNAi载体，利用脑立体定位将AAV9‑Oxtr‑RNAi病毒注射大鼠基底核区，根据脑部感染病理状态，结合临床女性因雌激素下降引起的老年痴呆症状进行检测评估，将大鼠随机分为sham组、con‑shRNA对照组、OXTR‑shRNA组，采用行为学Morris水迷宫实验和明暗箱实验检测大鼠的学习记忆能力；Elisa试剂盒检测大鼠脑组织皮质雌激素（Estrogen，E2）水平和乙酰胆碱神经递质（acetylcholine,Ach）水平变化；结合免疫荧光技术，观察脑基底核胆碱能神经元纤维投射区海马的传入神经纤维分别与OTR、ChAT的共定位及表达情况，可更好地探索和研究女性阿尔茨海默病的发病机制及其病理变化提供依据。

技术领域

本发明涉及受体基因沉默技术领域，具体涉及一种利用受体基因沉默技术构建和鉴定女性AD模型的方法。

背景技术

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种慢性进行性神经系统变性疾病，为常见的痴呆类型，其发病率逐年增加。目前，我国AD患者达到600万-1000万人，已是继心血管疾病和肿瘤之后的老年人死亡的第三大病因。胆碱能损伤是AD发病机制的核心，表现为神经元突触功能异常、锥体神经细胞丢失以及乙酰胆碱大量降解等，进而引起和促进一系列病理变化，最终导致AD复杂多样的病理特征和临床表现。因此临床上用于治疗AD的一线药物主要是拟胆碱药物，但其治疗效果并不理想，仅对1/3患者有改善，且不能完全控制疾病的发展，其长期效用也需进一步证实。由此可见，开发不仅能够对胆碱能神经元有调节作用，而且对多个AD特征的病理变化也有作用的新药将具有重要的现实意义和广阔的应用前景。

最新流行病学调查表明：1990-2014年65岁以上老年痴呆患病率为3%-8%，随着年龄组越高，患病率越高。60-64岁、65-69岁患病率男性高于女性，70-74岁、75-79岁、80-84岁、85岁以上患病率女性高于男性。研究发现，绝经早期开始给予雌激素补充治疗，持续5年时间，女性患AD的风险下降30％左右，连续使用10年以上，该风险降低更显著，尤其对于一些语言能力障碍、认知能力差的妇女有明显的效果。可见，AD高发群体为高龄老人和女性群体，除了女性平均寿命较长的原因外，绝经后妇女体内雌激素水平迅速下降也与AD之间存在某种联系。雌激素作为神经系统中一种重要的信号分子，不仅影响神经系统的结构和功能，还具有促进神经元存活、生长、修复、再生和神经突触可塑性等重要作用。胆碱能损伤是AD发生的关键机制，是神经元凋亡等其他AD发病机制的重要基础，最新的研究证实胆碱能和雌激素在脑内形成网络作用，通过各自信号通路发生相互作用改善AD病理状态。因此，寻找特异性的干扰胆碱能和雌激素相关信号通路的动物模型，可能成为防治女性老年痴呆的关键，也将成为医学界研究的热点趋势。

近年来研究发现，雌激素与胆碱能通路并不是简单运作的，它们之间存在着催产素，使得雌激素通路和胆碱能通路密切的相互联系，形成“串话”（Crosstalk）。一方面，雌激素调控催产素（oxytocin，OT）在下丘脑室旁核（paraventricular nucleus，PVN）神经细胞的合成；雌激素参与调节催产素受体（oxytocin receptor，OTR）在靶区域的表达，进而影响社会认知行为。OT通过与OTR结合发挥作用，OTR在脑内的表达又随雌激素水平升高而增加。由此可见，雌激素对催产素通路的调控是正调控效应。另一方面，不仅在以胆碱能神经元为主的基底前脑Meynert基底核（nucleus basalis of Meynert，NBM）中有大量催产素受体，而且在与学习记忆密切相关的胆碱能投射靶区海马和皮质也有催产素能神经纤维的传入。

发明内容

本发明的目的在于通过高效AAV9-Oxtr-RNAi 构建SD大鼠基底核区神经元催产素受体腺相关病毒载体（rAVV2-EGFP-OTR shRNA）动物模型，检测其病理形态以及脑内关键递质变化等，更好地探索和研究女性阿尔茨海默病的发病机制及其病理变化提供基础。