[发明专利]一种提高L-组氨酸产生菌生产能力的方法

说明书

本发明公开了一种提高L‑组氨酸产生菌生产能力的方法，包括下述步骤：对于大肠杆菌来源的ATP磷酸核糖基转移酶进行突变，获得酶活力提高的突变体；设计编码该突变体的基因；将所述编码基因整合入大肠杆菌的基因组中，获得基因工程菌。本发明的方法能够将L‑组氨酸生产菌的L‑组氨酸生产能力提高3.5倍以上。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种提高L-组氨酸产生菌生产能力的方法、一种L-组氨酸基因工程生产菌及其应用。

背景技术

L-组氨酸(L-histidine)是一种半必需氨基酸，对于婴幼儿及动物的成长尤其重要，随年龄增长人体开始可以自己合成它，此外它也可作为生化试剂或医药中间体，用于生产药物。据行业研究报告显示，2017年，全球的组氨酸消耗大致为，食用559.5吨，药物1516.2吨，饲料393.1吨，预计到2023年L-组氨酸消费量将达到3000-4000吨，市场需求量越来越大。

目前，L-组氨酸的制备主要有两种方法：国内主要是蛋白质水解方法制备(参见中国生化药物杂志,1982(02):12-17；CN101125831B)；国外主要通过谷氨酸棒杆菌或者大肠杆菌通过诱变获得高产L-组氨酸菌株通过微生物发酵方法制备(US8071339；CA02319283；CN1749390A；CN102286562A)。其中日本发酵公司协和和味之素的产量份额占90％以上。目前国内药用L-组氨酸主要通过进口，尚未实现微生物发酵法生产来自给。

在大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径中，一个关键酶--ATP磷酸核糖基转移酶(HisG)受到不同的中间代谢物和终产物抑制，尤其是终产物L-组氨酸的抑制。消除HisG的反馈抑制是组氨酸育种菌株中的重要步骤。先前报道的抗反馈抑制突变酶HisG^E271K被嘌呤核苷酸(特别是ADP和AMP)通过与ATP底物的竞争性抑制而被抑制，同时研究发现5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸(AICAR)也对ATP磷酸核糖基转移酶有极强的抑制(Malykh etal.,Microb Cell Fact.(2018),17:42)。通过对谷氨酸棒状杆菌中的HisG进行多个氨基酸位点突变，最后获得了N215K/L231F/T235A突变体，该突变体Ki值提高了37倍，发酵液中产物浓度由0.11mM提高到4.15mM，进而实现了组氨酸的高产(Biochimie,94(2012),p829-838)。

这些研究证明，通过基因工程手段获得更高产量的L-组氨酸生产菌株对于提高L-组氨酸生产的效益具有重要意义。

发明内容

为了构建L-组氨酸产量更高的基因工程菌株，本发明利用基因工程技术来改造产L--组氨酸的大肠杆菌。通过对组氨酸操纵子(his operon)进行改造，提高抗反馈抑制ATP磷酸核糖基转移酶的酶活力，获得L-组氨酸产量明显提高的菌株，从而提升了L-组氨酸的生产能力，具有广阔的工业化开发和应用前景。具体而言，本发明包括如下技术方案：

一种提高L-组氨酸产生菌生产能力的方法，包括以下步骤：

A.对大肠杆菌来源的ATP磷酸核糖基转移酶进行突变，获得酶活力提高的突变体；

B.设计编码步骤A中所得ATP磷酸核糖基转移酶突变体的基因；

C.将步骤B中所述基因整合入大肠杆菌的基因组中、或者替换大肠杆菌基因组中原始的ATP磷酸核糖基转移酶编码基因，获得基因工程菌。

在一种实施方式中，步骤A中所述的大肠杆菌是大肠杆菌W3110。

大肠杆菌W3110来源的ATP磷酸核糖基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:18。

优选地，上述突变体可以是SEQ ID NO:18的K136E、S226Ter突变体(其中Ter为终止子)，其氨基酸序列为SEQ ID NO:20。