[发明专利]一种可见光下裸眼可视的植物遗传转化的无损筛选系统、构建方法及其应用

说明书

本发明涉及一种植物遗传转化的无损筛选方法及其应用。植物遗传转化依赖高效的筛选系统，常用的筛选系统包括抗生素筛选、报告系统筛选。现有的报告系统筛选需要特殊的设备、昂贵的化学药品或对生物样品进行破坏性处理。本发明构建了一个新的报告基因RUBY，该基因合成的酶能将酪氨酸转化为红色的甜菜红素，本发明利用RUBY指示植物遗传转化的发生，成功实现可见光下裸眼可视的植物遗传转化的无损筛选。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种新的植物遗传转化报告系统及其应用。本发明的报告系统通过植物体内产生的可见光下可被裸眼直接观察的色素来指示。本发明还涉及上述报告系统的构建和应用。

背景技术

植物的遗传转化的筛选主要依赖抗生素或者除草剂进行筛选，通过在遗传转化的载体上添加一个抗生素或者除草剂抗性基因表达盒，发生遗传转化的植株则会表现出对特定抗生素或者除草剂的抗性。

但是抗生素或者除草剂筛选方法存在一些弊端。首先，不同种类植物对不同的抗生素的敏感性差异很大。少数植物，比如拟南芥、水稻、玉米、小麦、油菜等植物对潮霉素或新霉素或草甘膦较为敏感，可以用于筛选转基因植株，但是较多园艺植物或者林木对抗生素或者常用除草剂较不敏感，无法有效进行筛选。其次，一些植物在遗传转化过程中较容易发生非抗性组织逃逸现象，导致产生的遗传转化植株嵌合率高，无法有效筛选出纯合的转基因植株。第三，抗生素或者除草剂筛选策略无法较好的进行in-planta转化(直接对完整植株的某一部分组织进行遗传转化)中进行筛选。第四，抗生素或者除草剂筛选存在增加环境污染的风险。因此，通过在遗传转化的载体上添加一个报告基因表达盒，使用一些报告基因来指示和筛选植物的遗传转化成功发生也是一种常用的策略。

目前，已经开发了多种报告基因来指示和筛选转基因植株。首先，绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物(例如RFP、mCherry和YFP)作为报告基因是一种较常用的策略(ChalfieM,Tu Y,Euskirchen G,Ward WW,Prasher DC.Green fluorescent protein as a markerfor gene expression.Science,1994,263(5148):802-805；Heim R,Cubitt AB,TsienRY.Improved green fluorescence.Nature,1995,373(6516):663-664)。尽管GFP易于使用，但有局限性。荧光蛋白通常需要被特殊波长的光激发，并且只能观察到特殊波长的光，因此需要特殊的激发器作为光源，且观察时需要对自然光中的杂光进行遮挡，所以在植物遗传转化中使用荧光筛选较为繁琐。其次，β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)作为一种报告基因也被广泛用于植物中，用于监测转基因的成功发生(Jefferson RA,Kavanagh TA,Bevan MW.GUSfusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker inhigher plants.Embo j,1987,6(13):3901-3907)。第三，荧光素酶是另一个在植物和动物中均被广泛使用的报告分子，也能被用于检测转基因的成功发生(Contag CH,BachmannMH.Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression.Annu RevBiomed Eng,2002,4:235-260)。GUS和萤光素酶分别需要添加昂贵的底物X-Gluc(5-溴-4-氯-1H-吲哚-3-β-D-吡喃葡萄糖苷酸)和萤光素来进行显色反应，随后进行处理或者直接通过仪器观察，因此会对植物组织产生损伤或者破坏，或者增加无菌培养的组织被污染的可能。此外，荧光素酶催化底物产生的荧光也需要特殊的仪器进行拍照或观察。这些因素增加了这几种报告系统的检测成本并且限制了使用范围。