[发明专利]Mangicols二倍半萜化合物、合成方法、基因簇、核酸分子、构建体及其应用

权利要求书

1.一种Mangicols二倍半萜化合物的合成方法，其特征在于：所述Mangicols二倍半萜化合物结构如式I～V所示：

包含如下步骤：

1)构建异源合成二倍半萜化合物生物合成基因簇的微生物突变株；所述二倍半萜生物合成基因簇含有7个生物合成酶，其具有SEQ ID NO：1～7任一项所示的氨基酸序列；

2)制备微生物突变株AO-mgcDE和AO-mgcCDEF的发酵培养物，具体如下：

酶mgcE、mgcF、mgcG通过如下方法获得：

基于AntiSMASH软件，对丝状真菌禾谷镰刀菌J1-012菌株中的mangicols化合物生物合成基因簇进行生物信息学分析，发现该基因簇中含有2个与产物氧化有关的细胞色素P450基因即mgcE和mgcF，以及一个FMO类型的单加氧酶基因即mgcG；

质粒pYJ152、153、175通过如下方法构建：

pYJ152质粒构建：基于预测的mgcD的编码区信息，从F.graminearum J1-012基因组中分别扩增每一个外显子片段并在体外将其组装成包含完整编码区的mgcD基因即cDNA片段，随后用引物P1/P2扩增该基因；以pYH-WA-pyrG-KI质粒为模板，用引物P61/P62扩增含有ura基因及相应启动子和终止子的完整序列；以pTAex3质粒为模板，用P3/P64和P4/P63两对引物扩增载体序列；将上述扩增的4个片段用Yeast assembly方法进行组装，获得pYJ152质粒；

pYJ153质粒构建：基于预测的mgcE的编码区信息，从F.graminearum J1-012基因组中分别扩增每一个外显子片段并在体外将其组装成包含完整编码区的mgcE基因即cDNA片段，随后用引物P5/P6扩增该基因；以pYH-WA-pyrG-KI质粒为模板，用引物P61/P62扩增含有ura基因及相应启动子和终止子的完整序列；以pUSA质粒为模板，用P7/P63和P8/P64两对引物扩增载体序列；将上述扩增的4个片段用Yeast assembly方法进行组装，获得pYJ153质粒；

pYJ175质粒构建：用P17/P18引物从质粒pGB98上扩增glaA启动子序列；用P19/P20引物从F.graminearum J1-012基因组中扩增mgcC基因片段；用P21/P22引物从质粒pGB127上扩增niaD终止子序列；用P23/P24引物从模板pYJ174上扩增载体片段；将上述片段用Yeastassembly方法进行组装，得到pYJ175质粒；

微生物突变株AO-mgcDE和AO-mgcCDEF通过如下方法构建：

将质粒pYJ152转化到米曲霉中，得到含有萜类合酶基因mgcD的菌株AO-mgcD；将预测的具有氧化功能的三个酶mgcE、mgcF、mgcG分别同mgcD在米曲霉中进行异源表达；将质粒pYJ152和pYJ153共转化到米曲霉中，得到含有萜类合酶基因mgcD和P450酶基因mgcE的菌株AO-mgcDE；

将pYJ152、pYJ153和pYJ175共转化到米曲霉中，得到含有萜类合酶基因mgcD、P450酶基因mgcE、环氧化物水解酶基因mgcC和P450酶基因mgcF的菌株AO-mgcCDEF；

3)发酵培养物的萃取、分离及产物纯化；

所述微生物为米曲霉。

2.一种二倍半萜产物的制备方法，其特征在于：

将如权利要求1所述步骤2)中制备得到的AO-mgcDE和AO-mgcCDEF的发酵培养物分别用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩后得到粗提物A和B；粗提物A经反向硅胶柱层析，正己烷-乙酸乙酯体系梯度洗脱，收集正己烷/乙酸乙酯体积比5:1的馏分；将该馏分进行半制备HPLC纯化，以纯乙腈和超纯水为流动相，体积比75:25，90:10洗脱，收集馏分得到如权利要求1中所述式I～III所示的二倍半萜化合物；或者，

将粗提物B经反向硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯体系梯度洗脱，收集石油醚/乙酸乙酯体积比20:1的馏分；将该馏分进行氯仿-丙酮体系梯度洗脱，收集氯仿/丙酮体积比15:1的馏分；将该馏分再经HPLC纯化，以乙腈/水体积比45:55作为流动相洗脱，收集馏分得到如权利要求1中所述式IV和式V所示的二倍半萜化合物；

所述的二倍半萜化合物是从异源表达宿主微生物的发酵培养物中制备分离得到的；

所述微生物为米曲霉。