[发明专利]判别土壤中参与硝酸盐依赖性锑氧化过程的菌种及其关键功能基因的方法

权利要求书

1.一种判别土壤中参与硝酸盐依赖性锑氧化过程的菌种的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)采集存在锑污染的土壤，加入到无机盐培养基中，厌氧培养，直至消耗完土壤本底有机物；然后分成三组微宇宙体系，向第一组(¹³C+N+Sb)微宇宙体系加入¹³C-HCO₃^-、硝酸盐和Sb(III)进行培养，向第二组(¹²C+N+Sb)微宇宙体系加入¹²C-HCO₃^-、硝酸盐和Sb(III)进行培养，向第三组(¹³C+N)微宇宙体系加入¹³C-HCO₃^-和硝酸盐进行培养，三组微宇宙体系培养至少60天；

(2)对培养后的三组微宇宙体系，提取其中的土壤微生物总DNA，将所得DNA提取物加入CsCl溶液做超高速离心，收集各层离心组分；

(3)测定各层离心组分的BD值，以BD值将三组微宇宙体系的土壤微生物总DNA分成20-25个分层，去除各分层中的CsCl，并对各层离心组分做q-PCR扩增；

以各层离心组分的BD值为横坐标，以功能基因aioA的q-PCR扩增数值为纵坐标，作图；第一组(¹³C+N+Sb)微宇宙体系形成1个峰，BD值在1.70-1.76，为重质组分；第二组(¹²C+N+Sb)微宇宙体系形成1个峰，BD值在1.68-1.72，为轻质组分；第三组(¹³C+N)微宇宙体系形成1个峰，BD值在1.68-1.72，为轻质组分；

在三组微宇宙体系的重质或轻质组分中各选择1-3个q-PCR扩增数值较高的分层，进行16S rRNA基因V4-V5区域的高通量测序；

(4)将得到的16S rRNA V4-V5区域测序数据与已有的16S rRNA数据库进行比对，将具有97％以上相似度的划归为一个OTU，分析各个OTU在三组微宇宙体系中的丰度；

(5)在微生物群落测序结果中关注丰度较高的OTUs，通过以下步骤确定代表硝酸盐依赖性锑氧化的微生物：

第一步，排除(¹³C+N)组中在重质组分明显富集的OTUs；

第二步，在(¹²C+N+Sb)组的轻质组分富集，且在(¹³C+N+Sb)组重质组分富集的OTUs，就是具有硝酸盐依懒性锑氧化能力的微生物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述各组微宇宙体系中，¹³C-HCO₃^-的终浓度为0.3-0.6g/L，¹²C-HCO₃^-的终浓度为0.3-0.6g/L，硝酸盐的终浓度为0.1-0.3g/L，Sb(III)的终浓度为0.1-0.2g/L；培养过程中定期添加以上物质。