[发明专利]一种转座酶的筛选报告载体及其制备方法和应用

说明书

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种转座酶的筛选报告载体及其制备方法和应用。该筛选报告载体含有URA3基因表达盒，URA3基因中含有转座子片段，转座子片段的5’IR与3’IR之间含有抗生素抗性基因；及转座酶基因表达盒，转座酶片段可操作地连接有诱导型启动子元件。该筛选报告载体简化转座酶筛选评价步骤，提高评价效率和准确度。基于该筛选报告载体构建的转座酶的突变体库，实现突变DNA片段到酵母菌的一步克隆，及基于该报告载体和/或突变体库构建的转座酶的高通量筛选体系，该高通实现大批量突变体的一次筛选，同时提高准确度和稳定性，保证筛选高活性转座酶的概率。

技术领域

本发明属于分子生物学及生物医药领域，具体涉及一种转座酶的筛选报告载体及其制备方法和应用。

背景技术

DNA转座可以从在宿主基因组中一个位置移动到另一个位置，作为基因和插入诱变的实验室工具已经在果蝇、秀丽线虫、植物等多种生物中运用，但是在哺乳动物中的应用确受阻，这些转座子经常在哺乳动物细胞内存在无活性或者转座效率极低的现象。Sleeping Beauty是第一发现能在哺乳细胞内具有转座活性的DNA转座子，他的发现加速了突变小鼠和大鼠的产生，也让体内正向遗传筛选成为可能，此外，利用DNA转座子作为非病毒载体进行基因组编辑、制备CAR T细胞的应用前景备受关注。piggyBac转座子是从粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)TN368细胞系中分离的一种DNA转座子，是目前在哺乳动物细胞内最具应用价值的转座子，他具有搭载容量大、无痕切除等特性。可特异性的插入到“TTAA”把位点，借助转座酶，PiggyBac转座子可将目的基因从宿主精确切离，且切离后可恢复原有位点状态，不会留下转座子痕迹。

DNA转座子系统由两部分组成，两端带有反向重复序列(IRs)可携带目的DNA片段的转座子和能催化转座子发生“剪切和粘贴”的转座酶。转座酶首先结合转座子两侧的IRs序列，然后将转座子从宿主DNA位点精准地无痕移除，最终将DNA片段整合到新的位点上。高效转座系统的建立可以实现对靶基因的定点敲除或者目的基因的定点引入，为哺乳细胞内的基因编辑提供有效的载体工具。据报道，经过优化改造后的高活性Sleeping Beauty转座子SB100大大增加了转座效率，近期，欧洲分子生物学实验室Orsolya Barabas及德国维尔茨堡大学Michael Hudecek课题组也通过对SB的改造，设计出了设计创建具有增强的溶解性和稳定性的SB转座酶，并发表在Nature Biotechnology。转座系统的转座效率决定了基因编辑的效率，而转座效率很大一部分取决于转座酶的表达水平，因此，增加转座酶活性是增加转座子转座效率的关键技术点。

一种用于哺乳动物的高活性PiggyBac转移酶(A hyperactive piggyBactransposase for mammalian applications,PNAS|January 25,2011|vol.108|no.4|1531–1536)公开的转座酶的筛选报告载体中，转座子插入URA3基因中，转座子与URA3之间还连接有肌动蛋白内含子，当转座酶切除URA3基因中插入的转座子之后，URA3基因中仍存在插入的肌动蛋白内含子，为使URA3表达编码，还需进行激动蛋白内含子切除的繁琐操作，复杂化转座酶转座效率评估的步骤，降低效率、准确度和稳定性。该文献还公开一种转座效率为mPBase(经哺乳动物密码子优化的PiggyBac转移酶)10倍的进行以下位点氨基酸突变的高活性PiggyBac转移酶(指下述现有高活性转座酶hyPBase，经人类密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)：I30V、G165S、S103P、M282V、S509G、N570S和N538K。

因此，我们利用遗传操作相对简单的酿酒酵母建立了有效的筛选系统和高效的筛选流程，可高通量高效率的筛选到高活性转座酶。

发明内容

本发明提供一种转座酶的筛选报告载体及其制备方法，在检测转座酶转座功能的过程中，转座酶将插入URA基因中的转座子切除后，URA基因中不残留其他元件，简化除URA基因表达编码前URA基因中残留其他元件切除的繁琐步骤，提高转座酶转座功能评价的效率和准确度。