[发明专利]一种基于无核酸提取的文库构建检测结直肠癌标志物的试剂盒、方法及其应用

权利要求书

1.一种结直肠癌分子标志物的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括AKT1基因的引物对、BRAF基因的引物对、KRAS基因的引物对、NRAS基因的引物对、PIK3CA基因的引物对、PTEN基因的引物对和SMAD4基因的引物对。

2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物对的上游引物从5’到3’包括第一通用序列、随机标签序列和特异上游引物序列；

所述引物对的下游引物从5’到3’包括第二通用序列和特异下游引物序列；

优选地，所述随机标签序列的长度为5～10nt；

优选地，所述引物组合物包括SEQ ID NO:1～84所示的核酸序列。

3.一种文库构建试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组合物；

优选地，所述试剂盒还包括Ultra HIFIDNA聚合酶；

优选地，所述试剂盒还包括尿嘧啶DNA糖基酶、核酸外切酶I、PCR缓冲液、测序接头引物或纯化磁珠中的任意一种或至少两种的组合。

4.一种文库构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)对切片样本进行HE染色，根据肿瘤细胞比例利用划线法或激光捕获显微切割法获取肿瘤细胞；

(2)将获取的肿瘤细胞采用权利要求1或2所述的引物组合物进行第一轮线性PCR和第二轮指数PCR，磁珠纯化后得到添加有测序接头的PCR产物；

(3)采用测序接头引物对添加有测序接头的PCR产物进行第三轮PCR，磁珠纯化后得到测序文库。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述划线法包括在切片上划至少两组交叉的平行线，将切片划分为多个区域，收集区域内的肿瘤细胞的步骤；

优选地，步骤(1)所述激光捕获显微切割法包括激光切割肿瘤细胞，去除与肿瘤细胞黏连的间质细胞的步骤。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述第一轮线性PCR的条件包括92～98℃预变性5～15s；92～98℃变性5～15s、55～65℃退火5～15min，10～20个循环；

优选地，步骤(2)所述第二轮指数PCR的条件包括92～98℃预变性10～20min；92～98℃变性0.5～2min，58～64℃梯度退火0.5～2min，70～75℃延伸0.5～2min，3～6个循环；92～98℃变性20～40s，65～70℃退火1～5min，10～20个循环；

优选地，步骤(2)所述第二轮指数PCR进行预变性之前还包括35～40℃孵育5～15min的步骤。

7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述第三轮PCR的条件包括92～98℃预变性1～5min；92～98℃变性20～40s，65～70℃退火20～40s，70～75℃延伸0.5～2min，3～6个循环；70～75℃延伸3～5min。

8.根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤(2)所述第二轮指数PCR之后还包括对PCR产物进行核酸外切酶I处理的步骤；

优选地，所述核酸外切酶I处理的条件为35～40℃孵育10～30min，75～90℃孵育5～15min。

9.一种文库构建装置，其特征在于，所述装置包括：

肿瘤细胞获取单元，包括HE染色模块和肿瘤细胞获取模块，用于对切片样本进行HE染色，根据肿瘤细胞比例利用划线法或激光捕获显微切割法获取肿瘤细胞；

PCR扩增单元：包括第一轮线性PCR模块和第二轮指数PCR模块，用于对获取的肿瘤细胞采用权利要求1或2所述的引物组合物进行第一轮线性PCR和第二轮指数PCR；

文库获取单元：用于采用测序接头引物对添加有测序接头的PCR产物进行第三轮PCR。

10.一种权利要求1或2所述的引物组合物、权利要求3所述的试剂盒或权利要求9所述的装置在制备结直肠癌分子标志物检测试剂中的应用。