[发明专利]用于检测淡水环境中沼蛤的特异性引物、探针及试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测淡水环境中沼蛤的特异性引物，其特征在于：包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

2.一种用于检测淡水环境中沼蛤的荧光PCR探针，其特征在于：所述探针为如SEQ IDNO.3所示的Taqman探针；

所述探针序列5’端标记有荧光基团，探针序列3’端标记有淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的荧光PCR探针，其特征在于，所述荧光基团为FAM；所述淬灭基团为BHQ1。

4.一种用于检测淡水环境中沼蛤的荧光PCR试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所述的特异性引物，以及如权利要求2所述的荧光PCR探针。

5.根据权利要求4所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括反应缓冲液和Taq酶的预混液、阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为沼蛤目的扩增片段的体外重组质粒；所述阴性对照为灭菌去离子水。

6.一种用于检测淡水环境中沼蛤的荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取待检测水样的环境DNA；

以提取的环境DNA为模板，利用如权利要求1所述的特异性引物以及如权利要求2所述的荧光PCR探针进行荧光PCR扩增检测；

分析环境DNA模板的荧光PCR扩增检测结果，判定待测水样中是否含有沼蛤核酸。

7.根据权利要求6所述的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述荧光PCR扩增检测所采用的反应体系包括：10μL的2×Probe qPCR Master Mix，6.8μL的Nuclease-FreeWater，终浓度分别为200nM的正向引物、反向引物和荧光PCR探针，以及2μL的环境DNA模板；

作为优选，所述荧光PCR扩增检测的反应程序为：95℃预变性120s；95℃变性15s，60℃退火及延伸60s，共45个循环。

8.根据权利要求6所述的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述荧光PCR扩增检测是以沼蛤目的扩增片段的体外重组质粒为阳性对照，以灭菌去离子水为阴性对照，分别得到环境DNA模板、阳性对照和阴性对照的扩增曲线及Ct值。

9.根据权利要求8所述的荧光PCR检测方法，其特征在于，判定待测水样中是否含有沼蛤核酸的标准为：阳性对照出现S型扩增曲线，阴性对照无扩增曲线且无Ct值，待测水样出现S型扩增曲线，则判定待测水样中存在沼蛤核酸；待测水样未出现S型扩增曲线且无Ct值，则判定待测水样中无沼蛤核酸。

10.根据权利要求6所述的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述荧光PCR检测方法还包括：

以沼蛤目的扩增片段的体外重组质粒为标准品，利用如权利要求1所述的特异性引物以及如权利要求2所述的荧光PCR探针对不同拷贝数浓度的标准品进行荧光PCR扩增检测，得到Ct值；

将标准品的不同拷贝数浓度的对数值与Ct值绘制标准曲线，将环境DNA模板的荧光PCR扩增检测结果与所述标准曲线对比，得到待测水样中的沼蛤核酸拷贝数浓度。